Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang Toxoplasma gondii ay isang intracellular protozoan parasite na nagmo-modulate sa microenvironment ng infected host at kilala na nauugnay sa insidente ng paglaki ng brain tumor.Sa pag-aaral na ito, ipinapalagay namin na ang exosomal miRNA-21 mula sa impeksyon sa Toxoplasma ay nagtataguyod ng paglaki ng tumor sa utak.Ang mga exosome mula sa Toxoplasma-infected BV2 microglia ay nailalarawan at nakumpirma ang internalization ng U87 glioma cells.Ang mga exosomal microRNA expression profile ay nasuri gamit ang mga arrays ng microRNA at microRNA-21A-5p na nauugnay sa Toxoplasma gondii at pag-uuri ng tumor.Sinisiyasat din namin ang mga antas ng mRNA ng mga gen na nauugnay sa tumor sa mga U87 glioma cells sa pamamagitan ng pagbabago ng mga antas ng miR-21 sa mga exosome at ang epekto ng mga exosome sa paglaganap ng cell ng U87 glioma ng tao.Sa mga exosome ng U87 glioma cells na nahawaan ng Toxoplasma gondii, ang pagpapahayag ng microRNA-21 ay nadagdagan at ang aktibidad ng mga antitumor genes (FoxO1, PTEN, at PDCD4) ay nabawasan.Ang mga exosome na nagmula sa BV2 na nahawaan ng Toxoplasma ay nag-udyok sa paglaganap ng mga U87 glioma cells.Ang mga exosome ay nag-udyok sa paglaki ng mga U87 na selula sa isang modelo ng tumor ng mouse.Iminumungkahi namin na ang pagtaas ng exosomal miR-21 sa Toxoplasma-infected BV2 microglia ay maaaring gumanap ng isang mahalagang papel bilang isang tagataguyod ng paglago ng cell sa U87 glioma cells sa pamamagitan ng pag-downregulate ng mga antitumor genes.
Tinatayang mahigit 18.1 milyong kaso ng advanced cancer ang na-diagnose sa buong mundo noong 2018, na may humigit-kumulang 297,000 central nervous system tumor na na-diagnose bawat taon (1.6% ng lahat ng tumor)1.Ipinakita ng nakaraang pananaliksik na ang mga salik sa panganib para sa pagbuo ng mga tumor sa utak ng tao ay kinabibilangan ng iba't ibang kemikal na produkto, family history, at ionizing radiation mula sa head therapeutic at diagnostic equipment.Gayunpaman, ang eksaktong dahilan ng mga malignancies na ito ay hindi alam.Humigit-kumulang 20% ​​ng lahat ng kanser sa buong mundo ay sanhi ng mga nakakahawang ahente, kabilang ang mga virus, bakterya at mga parasito3,4.Ang mga nakakahawang pathogen ay nakakagambala sa mga genetic na mekanismo ng host cell, tulad ng pag-aayos ng DNA at ang cell cycle, at maaaring humantong sa talamak na pamamaga at pinsala sa immune system5.
Ang mga nakakahawang ahente na nauugnay sa kanser sa tao ay ang pinakakaraniwang viral pathogen, kabilang ang mga human papillomavirus at hepatitis B at C virus.Ang mga parasito ay maaari ding maglaro ng potensyal na papel sa pag-unlad ng kanser sa tao.Maraming uri ng parasito, katulad ng Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis at Hymenolepis nana, ay nasangkot sa iba't ibang uri ng kanser sa tao 6,7,8.
Ang Toxoplasma gondii ay isang intracellular protozoan na kumokontrol sa microenvironment ng mga nahawaang host cell.Ang parasite na ito ay tinatayang makakahawa sa humigit-kumulang 30% ng populasyon ng mundo, na inilalagay sa panganib ang buong populasyon9,10.Ang Toxoplasma gondii ay maaaring makahawa sa mga mahahalagang organo, kabilang ang central nervous system (CNS), at magdulot ng malubhang sakit tulad ng nakamamatay na meningitis at encephalitis, lalo na sa mga pasyenteng immunocompromised.Gayunpaman, maaari ring baguhin ng Toxoplasma gondii ang kapaligiran ng nahawaang host sa pamamagitan ng pag-modulate ng paglaki ng cell at immune response sa mga immunocompetent na indibidwal, na humahantong sa pagpapanatili ng isang asymptomatic na talamak na impeksyon9,11.Kapansin-pansin, dahil sa ugnayan sa pagitan ng T. gondii prevalence at brain tumor incidence, iminumungkahi ng ilang ulat na sa vivo host ang mga pagbabago sa kapaligiran dahil sa talamak na T. gondii infection ay kahawig ng tumor microenvironment.
Ang mga exosome ay kilala bilang mga intercellular communicator na naghahatid ng biological na nilalaman, kabilang ang mga protina at nucleic acid, mula sa mga kalapit na selula16,17.Ang mga exosome ay maaaring makaimpluwensya sa mga biological na proseso na nauugnay sa tumor tulad ng anti-apoptosis, angiogenesis, at metastasis sa tumor microenvironment.Sa partikular, ang mga miRNA (miRNAs), maliliit na non-coding na RNA na halos 22 nucleotides ang haba, ay mahalagang post-transcriptional gene regulators na kumokontrol sa higit sa 30% ng mRNA ng tao sa pamamagitan ng miRNA-induced silencing complex (miRISC).Ang Toxoplasma gondii ay maaaring makagambala sa mga biological na proseso sa pamamagitan ng pagkontrol sa expression ng miRNA sa mga nahawaang host.Ang mga host miRNA ay naglalaman ng mahahalagang signal para sa pag-regulate ng host biological na mga proseso upang makamit ang diskarte sa kaligtasan ng parasito.Kaya, ang pag-aaral ng mga pagbabago sa profile ng host miRNA sa impeksyon sa T. gondii ay makakatulong sa amin na maunawaan ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng host at T. gondii nang mas malinaw.Sa katunayan, Thirugnanam et al.Iminungkahi ng 15 na ang T. gondii ay nagtataguyod ng carcinogenesis ng utak sa pamamagitan ng pagbabago ng ekspresyon nito sa mga partikular na host miRNA na nauugnay sa paglaki ng tumor at nalaman na ang T. gondii ay maaaring magdulot ng mga glioma sa mga eksperimentong hayop.
Ang pag-aaral na ito ay nakatuon sa pagbabago ng exosomal miR-21 sa host microglia na nahawaan ng Toxoplasma BV2.Napansin namin ang isang posibleng papel ng binagong exosomal miR-21 sa paglaki ng U87 glioma cells dahil sa pagpapanatili sa nucleus ng FoxO1/p27, na siyang target ng overexpressed miR-21.
Ang mga exosome na nagmula sa BV2 ay nakuha gamit ang differential centrifugation at napatunayan ng iba't ibang mga pamamaraan upang maiwasan ang kontaminasyon sa mga bahagi ng cellular o iba pang mga vesicle.Ang SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ay nagpakita ng mga natatanging pattern sa pagitan ng mga protina na nakuha mula sa mga BV2 cells at exosome (Larawan 1A), at ang mga sample ay nasuri para sa pagkakaroon ng Alix, na sinuri ng Western blotting ng exosomal protein marker sa .Ang pag-label ng Alix ay natagpuan sa mga exosome na protina ngunit hindi sa BV2 cell lysate protein (Larawan 1B).Bilang karagdagan, ang purified RNA mula sa mga exosome na nagmula sa BV2 ay nasuri gamit ang isang bioanalyzer.Ang 18S at 28S ribosomal subunits ay bihirang naobserbahan sa exosomal RNA migration pattern, na nagpapahiwatig ng maaasahang kadalisayan (Larawan 1C).Sa wakas, ang transmission electron microscopy ay nagpakita na ang mga naobserbahang exosome ay humigit-kumulang 60-150 nm ang laki at mayroong isang cup-like structure na tipikal ng exosome morphology (Fig. 1D).
Pagkilala sa mga exosome na nagmula sa mga BV2 cells.(A) Pahina ng sheet ng data ng kaligtasan.Ang mga protina ay nahiwalay sa mga BV2 cells o exosome na nagmula sa BV2.Ang mga pattern ng protina ay naiiba sa pagitan ng mga cell at exosome.(B) Western blot analysis ng isang exosomal marker (Alix).(C) Pagsusuri ng purified RNA mula sa mga BV2 cells at BV2 na nagmula sa mga exosome gamit ang isang bioanalyzer.Kaya, ang 18S at 28S ribosomal subunits sa BV2 cells ay bihirang natagpuan sa exosomal RNA.( D ) Ipinakita ng transmission electron microscopy na ang mga exosome na nakahiwalay sa mga BV2 cells ay negatibong nabahiran ng 2% uranyl acetate.Ang mga exosome ay humigit-kumulang 60-150 nm ang laki at hugis-cup (Song at Jung, hindi na-publish na data).
Ang cellular internalization ng BV2-derived exosome sa U87 human glioma cells ay naobserbahan gamit ang confocal microscopy.Ang mga exosome na may label na PKH26 ay naisalokal sa cytoplasm ng mga U87 cells.Ang Nuclei ay nabahiran ng DAPI (Larawan 2A), na nagpapahiwatig na ang mga exosome na nagmula sa BV2 ay maaaring ma-internalize ng mga host cell at maimpluwensyahan ang kapaligiran ng mga cell ng tatanggap.
Internalization ng BV2-derived exosome sa U87 glioma cells at BV2-derived exosome na infected ng Toxoplasma RH induced proliferation ng U87 glioma cells.(A) Exosome na nilamon ng U87 cells na sinusukat ng confocal microscopy.Ang mga U87 glioma cells ay natupok ng mga exosome na may label na PKH26 (pula) o walang kontrol sa loob ng 24 na oras.Ang nuclei ay nabahiran ng DAPI (asul) at pagkatapos ay sinusunod sa ilalim ng isang confocal mikroskopyo (scale bar: 10 μm, x 3000).(B) Ang U87 glioma cell proliferation ay tinutukoy ng cell proliferation assay.Ang U87 glioma cells ay ginagamot ng mga exosome para sa ipinahiwatig na oras. *P <0.05 ay nakuha ng Student's t test. *P <0.05 ay nakuha ng Student's t test. *P <0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0.05 sa pamamagitan ng t-test ng Mag-aaral. *P <0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 nakuha gamit ang Student's t-test.
Matapos kumpirmahin ang internalization ng BV2-derived exosome sa U87 glioma cells, nagsagawa kami ng cell proliferation assays upang siyasatin ang papel ng BV2-derived Toxoplasma-derived exosome sa pagbuo ng human glioma cells.Ang paggamot sa mga U87 cells na may mga exosom mula sa T. gondii-infected BV2 cells ay nagpakita na ang T. gondii-infected BV2-derived exosome ay nagdulot ng mas mataas na proliferation ng U87 cells kumpara sa control (Fig. 2B).
Bilang karagdagan, ang paglago ng mga cell ng U118 ay may parehong mga resulta tulad ng U87, dahil ang Toxoplasma na pinasigla ang mga exosome ay nagdulot ng pinakamataas na antas ng paglaganap (hindi ipinakita ang data).Batay sa mga datos na ito, maaari naming ipahiwatig na ang BV2-derived Toxoplasma-infected exosome ay may mahalagang papel sa paglaganap ng glioma cell.
Upang imbestigahan ang epekto ng Toxoplasma-infected BV2-derived exosome sa tumor development, nag-inject kami ng U87 glioma cells sa mga nude mice para sa isang xenograft model at nag-inject ng BV2-derived exosome o RH-infected BV2-derived exosome.Matapos ang mga tumor ay naging maliwanag pagkatapos ng 1 linggo, ang bawat pang-eksperimentong grupo ng 5 mga daga ay hinati ayon sa laki ng tumor upang matukoy ang parehong panimulang punto, at ang laki ng tumor ay sinusukat sa loob ng 22 araw.
Sa mga daga na may modelong U87 xenograft, ang makabuluhang mas malaking laki at bigat ng tumor ay naobserbahan sa BV2-derived RH-infected exosome group sa araw na 22 (Fig. 3A,B).Sa kabilang banda, walang makabuluhang pagkakaiba sa laki ng tumor sa pagitan ng exosome group na nagmula sa BV2 at ng control group pagkatapos ng exosome na paggamot.Bilang karagdagan, ang mga daga na na-injected ng mga glioma cells at exosome ay biswal na ipinakita ang pinakamalaking dami ng tumor sa pangkat ng RH-infected BV2-derived exosome (Fig. 3C).Ang mga resultang ito ay nagpapakita na ang BV2-derived Toxoplasma-infected exosome ay naghihikayat sa paglaki ng glioma sa isang mouse tumor model.
Oncogenesis (AC) ng BV2-derived exosome sa isang U87 xenograft mouse model.Ang laki ng tumor (A) at timbang (B) ay makabuluhang nadagdagan sa BALB/c nude mice na ginagamot ng RH-infected exosome na nagmula sa BV2.Ang BALB/c nude mice (C) ay na-injected subcutaneously na may 1 x 107 U87 cells na nasuspinde sa Matrigel mixture.Anim na araw pagkatapos ng iniksyon, 100 μg ng BV2-derived exosome ay ginagamot sa mga daga.Ang laki at timbang ng tumor ay sinusukat sa ipinahiwatig na mga araw at pagkatapos ng sakripisyo, ayon sa pagkakabanggit. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P <0.05. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P <0.05.
Ipinakita ng data na 37 miRNAs (16 overexpressed at 21 downexpressed) na nauugnay sa immunity o tumor development ay makabuluhang binago sa microglia pagkatapos ng impeksyon sa Toxoplasma RH strain (Fig. 4A).Ang mga kamag-anak na antas ng expression ng miR-21 sa mga binagong miRNA ay nakumpirma ng real-time na RT-PCR sa mga exosome na nagmula sa BV2, mga exosome na ginagamot sa mga BV2 at U87 na mga cell.Ang pagpapahayag ng miR-21 ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa mga exosome mula sa mga selulang BV2 na nahawaan ng Toxoplasma gondii (RH strain) (Larawan 4B).Ang mga kamag-anak na antas ng pagpapahayag ng miR-21 sa mga BV2 at U87 na mga cell ay tumaas pagkatapos ng uptake ng mga binagong exosome (Fig. 4B).Ang mga kamag-anak na antas ng expression ng miR-21 sa mga tisyu ng utak ng mga pasyente ng tumor at mga daga na nahawaan ng Toxoplasma gondii (ME49 strain) ay mas mataas kaysa sa mga kontrol, ayon sa pagkakabanggit (Fig. 4C).Ang mga resulta na ito ay nauugnay sa mga pagkakaiba sa pagitan ng mga antas ng expression ng hinulaang at nakumpirma na mga microRNA sa vitro at sa vivo.
Mga pagbabago sa pagpapahayag ng exosomal miP-21a-5p sa microglia na nahawaan ng Toxoplasma gondii (RH).(A) Nagpapakita ng mga makabuluhang pagbabago sa siRNA na nauugnay sa kaligtasan sa sakit o pag-unlad ng tumor kasunod ng impeksyon sa T. gondii RH.(B) Ang mga kamag-anak na antas ng expression ng miR-21 ay nakita ng real-time na RT-PCR sa BV2-derived exosome, BV2-treated exosome, at U87 cells.(C) Ang mga kamag-anak na antas ng expression ng miR-21 ay natagpuan sa mga tisyu ng utak ng mga pasyente ng tumor (N=3) at mga daga na nahawaan ng Toxoplasma gondii (ME49 strain) (N=3). *P <0.05 ay nakuha ng Student's t test. *P <0.05 ay nakuha ng Student's t test. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 ay nakuha gamit ang Student's t-test. *P <0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 nakuha gamit ang Student's t-test.
Ang mga exosome mula sa RH-infected BV2 cells ay humantong sa paglaki ng mga glioma sa vivo at in vitro (Larawan 2, 3).Upang makita ang mga nauugnay na mRNA, sinuri namin ang mga antas ng mRNA ng mga antitumor target na gene, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN, at programmed cell death 4 (PDCD4) sa mga U87 na cell na nahawaan ng mga exosome na nagmula sa BV2 o RH BV2.Ipinakita ng pagsusuri ng bioinformatics na maraming mga gen na nauugnay sa tumor, kabilang ang mga gene ng FoxO1, PTEN, at PDCD4, ay may mga miR-2121,22 na nagbubuklod na site.Ang mga antas ng mRNA ng mga antitumor target na gene ay nabawasan sa RH-infected BV2-derived exosome kumpara sa BV2-derived exosome (Fig. 5A).Ang FoxO1 ay nagpakita ng pinababang antas ng protina sa RH-infected BV2-derived exosome kumpara sa BV2-derived exosome (Larawan 5B).Batay sa mga resultang ito, maaari naming kumpirmahin na ang mga exosome na nagmula sa RH-infected na BV2 ay nagpapababa ng mga anti-oncogenic na gene, na pinapanatili ang kanilang papel sa paglaki ng tumor.
Ang Toxoplasma RH-infected BV2-derived exosome ay nag-uudyok ng pagsugpo sa mga antitumor genes sa U87 glioma cells ng Toxoplasma RH-infected BV2-derived exosome.(A) Real-time na PCR ng FoxO1, PTEN at PDCD4 expression sa mga exosome na nagmula sa T. gondii RH-infected BV2 kumpara sa PBS exosome.Ang β-actin mRNA ay ginamit bilang isang kontrol.( B ) Ang expression ng FoxO1 ay natukoy ng Western blotting at ang data ng densitometry ay nasuri sa istatistika gamit ang programang ImageJ. *P <0.05 ay nakuha ng Student's t test. *P <0.05 ay nakuha ng Student's t test. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 ay nakuha gamit ang Student's t-test. *P <0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 nakuha gamit ang Student's t-test.
Upang maunawaan ang epekto ng miP-21 sa mga exosome sa regulasyon ng gene na nauugnay sa tumor, ang mga cell ng U87 ay inilipat na may isang inhibitor ng miP-21 gamit ang Lipofectamine 2000 at ang mga cell ay na-ani 24 na oras pagkatapos ng paglipat.Ang mga antas ng ekspresyon ng FoxO1 at p27 sa mga cell na inilipat gamit ang miR-21 inhibitors ay inihambing sa mga cell na ginagamot sa mga exosome na nagmula sa BV2 gamit ang qRT-PCR (Fig. 6A, B).Ang paglipat ng miR-21 inhibitor sa mga selulang U87 ay makabuluhang nag-downregulated ng FoxO1 at p27 expression (FIG. 6).
Binago ng RH-infected exosomal BV2-derived miP-21 expression ng FoxO1/p27 sa U87 glioma cells.Ang mga cell ng U87 ay inilipat gamit ang miP-21 inhibitor gamit ang Lipofectamine 2000 at ang mga cell ay na-ani 24 na oras pagkatapos ng paglipat.Ang mga antas ng expression ng FoxO1 at p27 sa mga cell na inilipat gamit ang mga miR-21 inhibitor ay inihambing sa mga antas sa mga cell na ginagamot sa mga exosome na nagmula sa BV2 gamit ang qRT-PCR (A, B).
Upang makatakas sa immune response ng host, ang Toxoplasma parasite ay nagiging tissue cyst.Pina-parasit nila ang iba't ibang mga tissue, kabilang ang utak, puso, at kalamnan ng kalansay, sa buong buhay ng host at binabago ang immune response ng host.Bilang karagdagan, maaari nilang i-regulate ang cell cycle at apoptosis ng mga host cell, na nagsusulong ng kanilang paglaganap14,24.Ang Toxoplasma gondii ay kadalasang nakakahawa sa host dendritic cells, neutrophils, at monocyte/macrophage lineage, kabilang ang brain microglia.Ang Toxoplasma gondii ay nagpapahiwatig ng pagkakaiba-iba ng mga macrophage ng M2 phenotype, nakakaapekto sa pagpapagaling ng sugat pagkatapos ng impeksyon sa pathogen, at nauugnay din sa hypervascularization at granulomatous fibrosis.Ang pathogenesis ng pag-uugali na ito ng impeksyon sa Toxoplasma ay maaaring nauugnay sa mga marker na nauugnay sa pag-unlad ng tumor.Ang pagalit na kapaligiran na kinokontrol ng Toxoplasma ay maaaring maging katulad ng kaukulang precancer.Samakatuwid, maaari itong ipalagay na ang impeksiyon ng Toxoplasma ay dapat mag-ambag sa pag-unlad ng mga tumor sa utak.Sa katunayan, ang mataas na rate ng impeksyon sa Toxoplasma ay naiulat sa serum ng mga pasyente na may iba't ibang mga tumor sa utak.Bilang karagdagan, ang Toxoplasma gondii ay maaaring isa pang carcinogenic effector at kumikilos nang magkakasabay upang tulungan ang iba pang mga nakakahawang carcinogen na magkaroon ng mga tumor sa utak.Sa pagsasaalang-alang na ito, ito ay nagkakahalaga ng noting na P. falciparum at Epstein-Barr virus synergistically nag-aambag sa pagbuo ng Burkitt's lymphoma.
Ang papel ng mga exosome bilang mga regulator sa larangan ng pananaliksik sa kanser ay malawakang sinisiyasat.Gayunpaman, ang papel ng mga exosome sa pagitan ng mga parasito at mga nahawaang host ay nananatiling hindi gaanong nauunawaan.Sa ngayon, ang iba't ibang mga regulator, kabilang ang mga sikretong protina, ay ipinaliwanag ang mga biological na proseso kung saan ang mga protozoan parasite ay lumalaban sa pag-atake ng host at nagpapanatili ng impeksyon.Kamakailan lamang, nagkaroon ng lumalagong konsepto na ang mga microvesicle na nauugnay sa protozoan at ang kanilang mga microRNA ay nakikipag-ugnayan sa mga host cell upang lumikha ng isang kanais-nais na kapaligiran para sa kanilang kaligtasan.Samakatuwid, ang mga karagdagang pag-aaral ay kinakailangan upang matuklasan ang kaugnayan sa pagitan ng mga binagong exosomal miRNA at paglaganap ng glioma cell.Ang pagbabago ng MicroRNA (mga cluster genes miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 at miR-17-92) ay nagbubuklod sa STAT3 promoter sa mga macrophage ng tao na nahawaan ng toxoplasma, ay kinokontrol at nagdudulot ng anti -apoptosis bilang tugon sa impeksyon ng Toxoplasma gondii 29 .Ang impeksyon ng Toxoplasma ay nagpapataas ng pagpapahayag ng miR-17-5p at miR-106b-5p, na nauugnay sa ilang mga hyperproliferative na sakit 30 .Iminumungkahi ng mga datos na ito na ang mga host miRNA na kinokontrol ng impeksyon ng Toxoplasma ay mahalagang mga molekula para sa kaligtasan ng parasito at pathogenesis sa host biological na pag-uugali.
Ang mga binagong miRNA ay maaaring maka-impluwensya sa iba't ibang uri ng pag-uugali sa panahon ng pagsisimula at pag-unlad ng mga malignant na selula, kabilang ang mga glioma: self-sufficiency ng growth signals, insensitivity sa growth-inhibiting signals, apoptosis evasion, unlimited replicative potential, angiogenesis, invasion at metastasis, at pamamaga.Sa glioma, ang mga binagong miRNA ay nakilala sa ilang mga pag-aaral sa profile ng expression.
Sa kasalukuyang pag-aaral, kinumpirma namin ang mataas na antas ng expression ng miRNA-21 sa mga host cell na nahawaan ng toxoplasma.Ang miR-21 ay nakilala bilang isa sa mga madalas na overexpress na microRNA sa mga solidong bukol, kabilang ang mga glioma, 33 at ang pagpapahayag nito ay nauugnay sa grado ng glioma.Ang pag-iipon ng ebidensya ay nagmumungkahi na ang miR-21 ay isang nobelang oncogene na gumaganap bilang isang anti-apoptotic na kadahilanan sa paglaki ng glioma at labis na na-overexpress sa mga tisyu at plasma ng mga malignancies sa utak ng tao.Kapansin-pansin, ang inactivation ng miR-21 sa mga glioma cells at tisyu ay nag-trigger ng pagsugpo sa paglaganap ng cell dahil sa caspase-dependent apoptosis.Ang bioinformatic analysis ng miR-21 na hinulaang mga target ay nagsiwalat ng maraming tumor suppressor genes na nauugnay sa mga landas ng apoptosis, kabilang ang programmed cell death 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, at forkhead box O1 (FoxO1), kasama ang miR-2121 binding site..22.38.
Ang FoxO1, bilang isa sa mga salik ng transkripsyon (FoxO), ay kasangkot sa pagbuo ng iba't ibang uri ng kanser sa tao at maaaring i-regulate ang pagpapahayag ng mga tumor suppressor genes tulad ng p21, p27, Bim, at FasL40.Ang FoxO1 ay maaaring magbigkis at mag-activate ng mga cell cycle inhibitors tulad ng p27 upang sugpuin ang paglaki ng cell.Bukod dito, ang FoxO1 ay isang pangunahing effector ng PI3K/Akt signaling at kinokontrol ang maraming biological na proseso tulad ng pag-unlad ng cell cycle at pagkita ng kaibahan ng cell sa pamamagitan ng pag-activate ng p2742 transcription.
Sa konklusyon, naniniwala kami na ang exosomal miR-21 na nagmula sa Toxoplasma-infected microglia ay maaaring may mahalagang papel bilang isang growth regulator ng glioma cells (Fig. 7).Gayunpaman, kinakailangan ang karagdagang pag-aaral upang makahanap ng direktang link sa pagitan ng exosomal miR-21, binagong impeksyon sa Toxoplasma, at paglaki ng glioma.Ang mga resultang ito ay inaasahang magbibigay ng panimulang punto para sa pag-aaral ng kaugnayan sa pagitan ng impeksyon sa Toxoplasma at ang saklaw ng glioma.
Ang isang schematic diagram ng mekanismo ng glioma (utak) carcinogenesis ay iminungkahi sa pag-aaral na ito.Ang may-akda ay gumuhit sa PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Ang lahat ng mga eksperimentong protocol sa pag-aaral na ito, kabilang ang paggamit ng mga hayop, ay alinsunod sa Seoul National University Animal Care at User Committee Standard Ethical Guidelines at inaprubahan ng Institutional Review Board ng Seoul National University School of Medicine (IRB number SNU- 150715).-2).Ang lahat ng mga eksperimentong pamamaraan ay isinagawa alinsunod sa mga rekomendasyon ng ARRIVE.
Ang BV2 mouse microglia at U87 human glioma cells ay nilinang sa Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) at Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), ayon sa pagkakabanggit, bawat isa ay naglalaman ng 10% fetal bovine serum, 4 mM l- glutamine, 0.2 mM penicillin at 0.05 mM streptomycin.Ang mga cell ay nilinang sa isang incubator na may 5% CO2 sa 37 ° C.Ang isa pang linya ng glioma cell, U118, ay ginamit para sa paghahambing sa mga cell ng U87.
Upang ihiwalay ang mga exosome mula sa T. gondii-infected RH at ME49 strains, ang T. gondii tachyzoites (RH strain) ay inani mula sa cavity ng tiyan ng 6-linggong BALB/c mice na na-injected 3-4 araw bago.Ang mga tachyzoites ay hinugasan ng tatlong beses gamit ang PBS at nilinis sa pamamagitan ng centrifugation sa 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Upang makakuha ng mga tachyzoites ng strain ME49, ang BALB/c mice ay intraperitoneally injected na may 20 tissue cysts at ang tachyzoite transformation sa cysts ay nakolekta sa pamamagitan ng paghuhugas ng abdominal cavity sa ika-6-8 na araw pagkatapos ng impeksyon (PI).Ang mga daga ay nahawaan ng PBS.Ang ME49 tachyzoites ay lumaki sa mga cell na pupunan ng 100 μg / ml penicillin (Gibco / BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg / ml streptomycin (Gibco / BRL), at 5% fetal bovine serum (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) sa 37 °C at 5% carbon dioxide.Pagkatapos ng paglilinang sa mga selula ng Vero, ang ME49 tachyzoites ay ipinasa nang dalawang beses sa pamamagitan ng isang 25 gauge na karayom ​​at pagkatapos ay sa pamamagitan ng isang 5 μm na filter upang alisin ang mga labi at mga cell.Pagkatapos ng paghuhugas, ang mga tachyzoites ay muling nasuspinde sa PBS44.Ang mga tissue cyst ng Toxoplasma gondii strain ME49 ay pinananatili ng intraperitoneal injection ng mga cyst na nakahiwalay sa utak ng mga nahawaang C57BL/6 na daga (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Ang utak ng ME49-infected na mga daga ay inani pagkatapos ng 3 buwan ng PI at tinadtad sa ilalim ng mikroskopyo upang ihiwalay ang mga cyst.Ang mga nahawaang daga ay pinananatili sa ilalim ng mga espesyal na kondisyon na walang pathogen (SPF) sa Seoul National University School of Medicine.
Ang kabuuang RNA ay nakuha mula sa BV2-derived exosome, BV2 cells at tissue gamit ang miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa, kabilang ang oras ng pagpapapisa ng itlog para sa hakbang ng elution.Natukoy ang konsentrasyon ng RNA sa isang NanoDrop 2000 spectrophotometer.Ang kalidad ng RNA microarrays ay nasuri gamit ang isang Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Netherlands).
Ang DMEM na may 10% exosome-poor FBS ay inihanda ng ultracentrifugation sa 100,000g sa loob ng 16 na oras sa 4°C at na-filter sa pamamagitan ng isang 0.22 µm na filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).Ang mga cell ng BV2, 5 × 105, ay nilinang sa DMEM na naglalaman ng 10% exosome-depleted FBS at 1% antibiotics sa 37 ° C at 5% CO2.Matapos ang 24 na oras ng pagpapapisa ng itlog, ang mga tachyzoites ng strain RH o ME49 (MOI = 10) ay idinagdag sa mga cell at ang mga hindi sumasalakay na mga parasito ay tinanggal sa loob ng isang oras at napuno ng DMEM.Ang mga exosome mula sa mga cell ng BV2 ay nahiwalay sa pamamagitan ng binagong differential centrifugation, ang pinakamalawak na ginagamit na pamamaraan.Isuspinde muli ang exosome pellet sa 300 µl PBS para sa pagsusuri ng RNA o protina.Ang konsentrasyon ng mga nakahiwalay na exosome ay natukoy gamit ang isang BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA) at isang NanoDrop 2000 spectrophotometer.
Ang mga precipitates mula sa BV2 cells o exosome na nagmula sa BV2 ay na-lysed sa PRO-PREP™ protein extraction solution (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) at ang mga protina ay na-load sa Coomassie brilliant blue stained 10% SDS polyacrylamide gels.Bilang karagdagan, ang mga protina ay inilipat sa mga lamad ng PVDF sa loob ng 2 oras.Ang mga Western blots ay napatunayan gamit ang Alix antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) bilang isang exosomal marker.Ang HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) at isang LAS-1000 plus luminescent image analyzer (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) ay ginamit bilang pangalawang antibody..Ang transmission electron microscopy ay isinagawa upang pag-aralan ang laki at morpolohiya ng mga exosome.Ang mga exosome na nakahiwalay sa mga BV2 cells (6.40 µg/µl) ay inihanda sa carbon-coated meshes at negatibong nabahiran ng 2% uranyl acetate sa loob ng 1 min.Ang mga inihandang sample ay naobserbahan sa isang accelerating na boltahe ng 80 kV gamit ang isang JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) na nilagyan ng ES1000W Erlangshen CCD camera (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Ang mga exosome na nagmula sa BV2 ay na-stain gamit ang PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sa loob ng 15 minuto sa temperatura ng silid.Ang mga cell ng U87, 2 × 105, na may mga exosom na may label na PKH26 (pula) o walang mga exosome bilang negatibong kontrol, ay na-incubate sa 37 ° C sa loob ng 24 na oras sa isang 5% CO2 incubator.Ang U87 cell nuclei ay nabahiran ng DAPI (asul), ang mga U87 na selula ay naayos sa 4% paraformaldehyde sa loob ng 15 min sa 4 ° C at pagkatapos ay sinuri sa isang Leica TCS SP8 STED CW confocal microscope system (Leica Microsystems, Mannheim, Germany).mapapansin.
Ang cDNA ay na-synthesize mula sa siRNA gamit ang Mir-X siRNA na unang strand synthesis at SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Ang real time quantitative PCR ay isinagawa gamit ang iQ5 real time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gamit ang mga primer at template na hinaluan ng SYBR Premix.Ang DNA ay pinalaki para sa 40 cycle ng denaturation sa 95 ° C para sa 15 s at pagsusubo sa 60 ° C para sa 60 s.Ang data mula sa bawat reaksyon ng PCR ay nasuri gamit ang data analysis module ng iQ™5 optical system software (Bio-Rad).Ang mga kamag-anak na pagbabago sa expression ng gene sa pagitan ng mga napiling target na gene at β-actin/siRNA (at U6) ay kinakalkula gamit ang karaniwang paraan ng curve.Ang mga panimulang sequence na ginamit ay ipinapakita sa Talahanayan 1.
Ang 3 x 104 U87 na mga glioma cells ay na-seed sa 96-well plate at hinaluan ng Toxoplasma-infected exosome na nagmula sa BV2 (50 μg/mL) o nonpulse exosome na nagmula sa BV2 (50 μg/mL) bilang mga kontrol sa 12, 18 at 36 na oras .Natutukoy ang rate ng paglaganap ng cell gamit ang Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Mga Pandagdag na Larawan S1-S3) 46 .
Ang 5-linggong babaeng BALB/c nude mice ay binili mula sa Orient Bio (Seongnam-si, South Korea) at itinago nang paisa-isa sa mga sterile cage sa temperatura ng kuwarto (22±2°C) at halumigmig (45±15°C).%) sa temperatura ng silid (22±2°C) at halumigmig (45±15%).Isang 12-hour light cycle at 12-hour dark cycle ang isinagawa sa ilalim ng SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Ang mga daga ay sapalarang nahahati sa tatlong grupo ng 5 mga daga bawat isa at ang lahat ng mga grupo ay na-injected subcutaneously na may 400 ml ng PBS na naglalaman ng 1 x 107 U87 glioma cells at ang growth factor ay nabawasan ang BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Anim na araw pagkatapos ng pag-iniksyon ng tumor, 200 mg ng exosome na nagmula sa mga BV2 cells (na may/walang impeksyon sa Toxoplasma) ay na-injected sa tumor site.Dalawampu't dalawang araw pagkatapos ng impeksyon sa tumor, ang laki ng tumor ng mga daga sa bawat pangkat ay sinusukat gamit ang isang caliper tatlong beses sa isang linggo, at ang dami ng tumor ay kinakalkula ng formula: 0.5 × (lapad) × 2 × haba.
Pagsusuri ng expression ng MicroRNA gamit ang miRCURYTM LNA miRNA array, ang ika-7 henerasyon ay may, mmu at rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Denmark) na sumasaklaw sa 1119 well-characterized na daga sa 3100 human, mouse at rat miRNA capture probes.Sa panahon ng pamamaraang ito, 250 hanggang 1000 ng kabuuang RNA ay tinanggal mula sa 5′-phosphate sa pamamagitan ng paggamot na may calf intestinal alkaline phosphatase na sinusundan ng pag-label na may Hy3 green fluorescent dye.Ang mga may label na sample ay pagkatapos ay na-hybrid sa pamamagitan ng pag-load ng mga microarray slide gamit ang isang hybridization chamber kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) at isang hybridization slide kit (Agilent Technologies).Ang hybridization ay isinagawa sa loob ng 16 na oras sa 56 ° C, pagkatapos ay ang mga microarray ay hugasan alinsunod sa mga rekomendasyon ng tagagawa.Ang mga naprosesong microarray slide ay na-scan gamit ang isang Agilent G2565CA microarray scanner system (Agilent Technologies).Ang mga na-scan na larawan ay na-import gamit ang Agilent Feature Extraction software na bersyon 10.7.3.1 (Agilent Technologies) at ang fluorescence intensity ng bawat larawan ay sinukat gamit ang kaukulang GAL file ng binagong Exiqon protocol.Ang data ng microarray para sa kasalukuyang pag-aaral ay idineposito sa database ng GEO sa ilalim ng numero ng pag-access na GPL32397.
Ang mga profile ng expression ng mga mature na exosomal miRNA sa microglia ng RH o ME49 na mga strain na nahawaan ng Toxoplasma ay nasuri gamit ang iba't ibang mga tool sa network.Ang mga miRNA na nauugnay sa pag-unlad ng tumor ay nakilala gamit ang miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) at na-filter na may normalized na intensity ng signal (log2) na higit sa 8.0.Sa mga miRNA, natuklasang higit sa 1.5-tiklop na binago ang mga miRNA na may pagkakaiba na ipinahayag sa pamamagitan ng pagsusuri ng filter ng mga miRNA na binago ng mga strain ng RH o ME49 na nahawaan ng T. gondii.
Ang mga cell ay na-seeded sa anim na balon na mga plato (3 x 105 na mga cell / well) sa opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) gamit ang Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Ang mga nailipat na mga cell ay nilinang sa loob ng 6 na oras at pagkatapos ay ang daluyan ay binago sa sariwang kumpletong daluyan.Ang mga cell ay inani 24 na oras pagkatapos ng paglipat.
Pangunahing isinagawa ang pagtatasa ng istatistika gamit ang t-test ng Mag-aaral na may software ng Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Para sa pang-eksperimentong pagsusuri ng hayop, ang isang two-way na ANOVA ay isinagawa gamit ang Prism 3.0 software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Ang mga P-values ​​<0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika. Ang mga P-values ​​​​<0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Ang mga halaga ng P <0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Ang mga halaga ng P <0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika.
Ang lahat ng mga eksperimentong protocol na ginamit sa pag-aaral na ito ay naaprubahan ng Institutional Review Board ng Seoul National University School of Medicine (IRB number SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Tinantyang global cancer incidence at mortality noong 2018: GLOBOCAN sources at method.Interpretasyon.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Isang pananaw sa mga kadahilanan ng panganib ng mga tumor sa utak at ang kanilang mga therapeutic intervention. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Isang pananaw sa mga kadahilanan ng panganib ng mga tumor sa utak at ang kanilang mga therapeutic intervention.Rashid, S., Rehman, K. at Akash, MS Isang pagsusuri ng mga kadahilanan ng panganib para sa mga tumor sa utak at mga pangunahing therapeutic intervention. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Malalim na pag-unawa sa mga kadahilanan sa panganib ng tumor sa utak at mga therapeutic na interbensyon.Rashid, S., Rehman, K. at Akash, MS Isang pagsusuri ng mga kadahilanan ng panganib para sa mga tumor sa utak at mga pangunahing therapeutic intervention.Biomedical na agham.Pharmacist.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterial-viral na pakikipag-ugnayan sa human orodigestive at female genital tract cancers: Isang buod ng epidemiologic at laboratoryo na ebidensya. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterial-viral na pakikipag-ugnayan sa human orodigestive at female genital tract cancers: Isang buod ng epidemiologic at laboratoryo na ebidensya.Kato I., Zhang J. at Sun J. Bacterial-viral na pakikipag-ugnayan sa cancer ng gastrointestinal tract ng tao at female genital tract: isang buod ng data ng epidemiological at laboratoryo. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bacterio-viral na pakikipag-ugnayan sa pantunaw ng oral cavity ng tao at babaeng reproductive tract: buod ng sikat na sakit sa agham at ebidensya sa laboratoryo.Kato I., Zhang J. at Sun J. Bacterial-viral na pakikipag-ugnayan sa gastrointestinal cancer ng tao at babaeng genital cancer: isang buod ng data ng epidemiological at laboratoryo.Kanser 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Mula sa impeksyon hanggang sa cancer: Paano binabago ng mga virus ng DNA tumor ang host cell central carbon at lipid metabolism. Magon, KL & Parish, JL Mula sa impeksyon hanggang sa cancer: Paano binabago ng mga virus ng DNA tumor ang host cell central carbon at lipid metabolism.Mahon, KL at Parish, JL Impeksyon sa sunog sa cancer: kung paano binabago ng mga virus ng tumor na nakabatay sa DNA ang host cell central carbon at metabolismo ng lipid. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Mula sa impeksyon hanggang sa cancer: kung paano binabago ng mga virus ng DNA tumor ang host cell central carbon at lipid metabolism.Mahon, KL at Parish, JL Nagpaputok ng impeksyon sa cancer: kung paano binabago ng mga virus ng tumor ng DNA ang central carbon at lipid metabolism sa mga host cell.Open Biology.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catechol estrogens ng schistosomes at liver flukes at helminth-associated cancer.harap.mainit sa loob.5, 444 (2014).