Ang Giardia duodenum ay isang parasitiko na organismo na nagdudulot ng giardiasis, isang impeksyon sa bituka lalo na karaniwan sa mga maliliit na bata na may mga klinikal na palatandaan ng pagtatae.Nauna naming naiulat na ang extracellular G. duodenalis ay nag-trigger ng pag-activate ng intracellular oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) binding nucleotides at kinokontrol ang host inflammatory responses sa pamamagitan ng extracellular vesicle (EV) secretion.Gayunpaman, ang eksaktong mga pattern ng molekular ng pathogen-associated duodenococcal EV (GEV) na kasangkot sa prosesong ito at ang papel ng NLRP3 inflammasome sa giardiasis ay nananatiling maipaliwanag.
Ang mga recombinant na eukaryotic expression plasmids na pcDNA3.1(+)-alpha-2 at alpha-7.3 giardins sa GEV ay itinayo, inilipat sa pangunahing peritoneal macrophage ng mouse, at natukoy sa pamamagitan ng pagsukat sa target ng pamamaga na molekula na caspase-1.Na-screen ang p20 expression level..Ang G. duodenalis alpha-2 at alpha-7.3 giardines ay orihinal na nakilala sa pamamagitan ng pagsukat ng NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 at caspase-1 p20), IL secretion.1β level, apoptotic spotted protein (ASC) oligomerization level, at immunofluorescent localization ng NLRP3 at ASC.Ang papel ng NLRP3 inflammasome sa pathogenicity ng G. duodenalis ay pagkatapos ay nasuri gamit ang mga daga kung saan ang NLRP3 activation ay hinarangan (NLRP3 blocked mice) at mga pathological na pagbabago sa timbang ng katawan, duodenal parasitic load, at duodenal tissue ay sinusubaybayan.Bilang karagdagan, sinisiyasat namin kung ang hiardines alpha-2 at alpha-7.3 ay nag-udyok ng pagtatago ng IL-1β sa vivo sa pamamagitan ng pamamaga ng NLRP3 at natukoy ang papel ng mga molekulang ito sa pathogenicity ng G. duodenalis sa mga daga.
Ang Alpha-2 at alpha-7.3 giardines ay nag-udyok sa pag-activate ng NLRP3 inflammasome sa vitro.Ito ay humantong sa pag-activate ng p20 caspase-1, isang pagtaas sa mga antas ng expression ng NLRP3, pro-IL-1β, at pro-caspase-1 na mga protina, isang makabuluhang pagtaas sa pagtatago ng IL-1β, ang pagbuo ng mga ASA spot sa cytoplasm, at ang induction ng ASA oligomerization.Ang pamamaga ng NLRP3 Ang pagkawala ng penile ay nagpapalala sa pathogenicity ng G. duodenalis sa mga daga.Ang mga daga na ginagamot ng mga cyst sa pamamagitan ng gavage mula sa NLRP3-blocked na mga daga ay nagpakita ng tumaas na bilang ng mga trophozoites at matinding pinsala sa duodenal villi, na nailalarawan sa pamamagitan ng necrotic crypts na may shrunken at branching.Ipinakita ng mga eksperimento sa vivo na ang giardines alpha-2 at alpha-7.3 ay maaaring magdulot ng pagtatago ng IL-1β sa pamamagitan ng NLRP3 inflammasome, at ang pagbabakuna na may giardines alpha-2 at alpha-7.3 ay nagbawas ng pathogenicity ng G. duodenalis sa mga daga.
Kung sama-sama, ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay nagmumungkahi na ang giardia alpha-2 at alpha-7.3 ay nagdudulot ng upregulation ng host NLRP3 na pamamaga at binabawasan ang infectivity ng G. duodenalis sa mga daga, na mga promising target para maiwasan ang giardiasis.
Ang Giardia duodenum ay isang extracellular protozoan parasite na naninirahan sa maliit na bituka at nagiging sanhi ng 280 milyong kaso ng giardiasis na may pagtatae taun-taon, lalo na sa mga maliliit na bata sa mga umuunlad na bansa [1].Ang mga tao ay nahawahan sa pamamagitan ng pag-inom ng tubig o pagkain na kontaminado ng M. duodenum cysts, na pagkatapos ay pumapasok sa tiyan at ilalabas sa mga gastric juice.Ang Giardia duodenum trophozoites ay nakakabit sa duodenal epithelium, na nagiging sanhi ng pagduduwal, pagsusuka, pagtatae, pananakit ng tiyan, at pagbaba ng timbang.Ang mga indibidwal na may immunodeficiency at cystic fibrosis ay madaling kapitan ng impeksyon.Ang impeksyon ay maaari ding mangyari sa pamamagitan ng oral at anal sex [2].Ang mga gamot tulad ng metronidazole, tinidazole, at nitazoxanide ay ang ginustong mga opsyon sa paggamot para sa mga impeksyon sa duodenal [3].Gayunpaman, ang mga chemotherapy na gamot na ito ay nagdudulot ng masamang epekto tulad ng pagduduwal, carcinogenesis, at genotoxicity [4].Samakatuwid, ang mga mas epektibong estratehiya ay kailangang bumuo upang maiwasan ang impeksyon ng G. duodenalis.
Ang mga inflammasome ay isang klase ng mga cytosolic protein complex na bahagi ng likas na tugon ng immune, na tumutulong na ipagtanggol laban sa pagsalakay ng pathogen at pumagitna sa mga nagpapaalab na tugon [5].Sa mga inflammasom na ito, ang nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome ay malawakang pinag-aralan dahil ito ay matutukoy ng iba't ibang pathogen/damage-associated molecular patterns (PAMP). DAMP), kinikilala, pinapagana ang likas na immune system.at kinokontrol ang homeostasis ng bituka sa maraming mga nagpapaalab na sakit [6,7,8].Binubuo ito ng pattern recognition receptor (PRR) NLRP3, isang adaptor na apoptotic spotted protein (ASC), at isang effector procaspase-1 o procaspase-11.Ang NLRP3 inflammasome ay kumikilos bilang isang host laban sa pagsalakay ng pathogen, tulad ng naobserbahan sa Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], at Leishmania na pag-aaral.[11], ngunit naiulat din na ang pag-activate ng NLRP3 inflammasome ay naglilimita sa mga proteksiyon na tugon ng immune at nagpapalala sa paglala ng sakit, halimbawa, sa mga bulate [12].Batay sa aming mga nakaraang natuklasan, iniulat namin na ang extracellular G. duodenalis ay nag-trigger ng intracellular activation ng pamamaga ng NLRP3 at nagmo-modulate ng host inflammatory responses sa pamamagitan ng pagtatago ng extracellular vesicles (EVs) [13].Gayunpaman, ang papel ng NLRP3 inflammasome sa impeksyon ng G. duodenalis sa vivo ay nananatiling tinutukoy.
Ang Giardins ay orihinal na inilarawan bilang mga istrukturang bahagi ng G. duodenalis cytoskeleton at may mahalagang papel sa trophozoite motility at epithelial cell attachment sa maliit na bituka.Upang mas mahusay na umangkop sa kapaligiran at madagdagan ang kanilang pathogenicity, ang G. duodenalis trophozoites ay bumuo ng isang natatanging istraktura ng cytoskeletal na binubuo ng 8 flagella, 1 gitnang katawan, at 1 ventral disc [14].Ginagamit ng trophozoites ng Giardia duodenum ang kanilang cytoskeleton upang tumagos sa itaas na maliit na bituka, lalo na sa duodenum, at nakakabit sa mga enterocytes.Patuloy silang lumilipat at nakakabit sa mga epithelial cells gamit ang cell metabolism.Samakatuwid, mayroong malapit na kaugnayan sa pagitan ng kanilang cytoskeleton at virulence.Ang mga Giardine na tiyak para sa Giardia duodenum ay mga bahagi ng istruktura ng cytoskeleton [15] at nahahati sa apat na klase: α-, β-, γ-, at δ-giardines.Mayroong 21 miyembro ng pamilyang α-giardin, na lahat ay may kakayahang umaasa sa calcium na magbigkis ng mga phospholipid [16].Ikinonekta din nila ang cytoskeleton sa lamad ng cell.Sa mga indibidwal na may pagtatae na dulot ng G. duodenalis, ang mga α-giardin ay lubos na ipinahayag at immunoreactive sa panahon ng impeksiyon [17].Ang mga heterologous na bakuna batay sa Giardia alfa-1 ay protektado laban sa giardiasis sa mga daga at mga potensyal na antigen ng kandidato para sa pagbuo ng bakuna [18].Ang Alpha-8 giardin, na naisalokal sa lamad ng plasma at flagella, ngunit hindi sa ventral disc, pinahuhusay ang motility at rate ng paglago ng trophozoites sa G. duodenalis [19].Ang Alpha-14 giardin ay nakakabit sa mga istruktura ng microtubule sa flagella at nakakaapekto sa posibilidad na mabuhay ng G. duodenalis [20].Ang Alpha-11 giardine ay naroroon sa kasaganaan sa buong ikot ng buhay, at ang sobrang pagpapahayag ng alpha-11 giardine ay nakakapinsala sa G. duodenalis mismo [21].Gayunpaman, hindi malinaw kung ang alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine ay proteksiyon laban sa impeksyon ng G. duodenalis at ang kanilang mga pinagbabatayan na mekanismo.
Sa pag-aaral na ito, ang recombinant eukaryotic expression plasmids na pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine at pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ay inilipat sa mouse primary peritoneal macrophage para ma-activate ang host NLRP3.Ang mga inflammasome na target ay sinuri.Sinuri din namin ang papel ng NLRP3 inflammasome sa pathogenicity ng G. duodenalis, sinisiyasat kung ang alpha-2 at alpha-7,3 giardines ay nag-udyok sa pag-activate ng NLRP3 inflammasome sa vivo, at natukoy na ang dalawang papel na ito ng giardines sa pathogenicity ng G. duodenalis.Ang aming karaniwang layunin ay bumuo ng mga promising target para sa pag-iwas sa impeksyon ng G. duodenalis.
Ang wild type (WT) C57BL/6 na babaeng daga na may edad 5-8 na linggo ay binili mula sa Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China).Ang mga daga ay may libreng access sa tubig, nakatanggap ng isterilisadong pagkain at pinananatili sa isang 12/12 oras na ilaw/madilim na cycle.Bago ang impeksyon, ang mga daga ay tumanggap ng antibiotics ad libitum sa inuming tubig na dinagdagan ng ampicillin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), at neomycin (1.4 mg/mL) (lahat ay binili mula sa Shanghai, China, mga artipisyal na organismo) [22 ].].Ang mga daga na nawalan ng kakayahang kumain at uminom ng higit sa 24 na oras at nawalan ng ≥ 20% na timbang sa katawan ay makataong na-euthanize ng cervical dislocation.
Ang WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) ay dinagdagan ng 12.5% ​​​​fetal bovine serum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) at 0.1% bovine bile (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) sa ilalim ng microaerobic na kondisyon.Ang mga confluent trophozoites ay nakolekta sa yelo at ipinasa sa isang ratio na 1: 4 para sa karagdagang pagpaparami.
Ang mga Giardia duodenum cyst ay na-induce tulad ng inilarawan dati [23], ang mga trophozoites ay inani sa logarithmic phase at pagkatapos ay diluted na may encapsulation inducing medium, pH 7.1 (binagong TYI-S-33) hanggang sa panghuling konsentrasyon na 1 × 106 trophozoites/mL.konsentrasyon ng apdo 0.05% daluyan).Ang mga trophozoites ay nilinang sa ilalim ng anaerobic na mga kondisyon sa 37 ° C hanggang sa yugto ng paglago ng logarithmic.Baguhin ang medium sa cyst inducing medium (pH 7.8; binagong TYI-S-33 medium na may 1% na konsentrasyon ng apdo) at kultura G. duodenalis sa 37°C sa loob ng 48-96 na oras, kung saan ang pagbuo ng mga cyst ay naobserbahan sa ilalim ng mikroskopyo.Matapos ang karamihan sa mga trophozoites ay mahikayat na bumuo ng mga cyst, ang pinaghalong kultura ay inani at muling sinuspinde sa sterile deionized na tubig upang i-lyse ang natitirang mga trophozoites.Ang mga cyst ay binibilang at iniimbak sa 4°C para sa kasunod na pagsusuri sa pamamagitan ng gastric tube sa mga daga.
Ang Giardia extracellular vesicle (GEVs) ay pinayaman tulad ng inilarawan dati [13].Ang mga trophozoites sa logarithmic growth phase ay muling nasuspinde sa binagong TYI-S-33 medium na inihanda gamit ang exosome-depleted FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 1 × 106 parasites/mL at incubated sa loob ng 12 oras.ay nakahiwalay mula sa supernatant ng kultura sa pamamagitan ng sentripugasyon sa 2000 g para sa 10 min, 10,000 g para sa 45 min, at 100,000 g para sa 60 min.Ang mga precipitate ay natunaw sa phosphate buffered saline (PBS), na binibilang gamit ang BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) at inimbak sa -80° C. o direktang ginamit para sa karagdagang pagsusuri.
Ang pangunahing mouse peritoneal macrophage ay inihanda tulad ng inilarawan dati [24].Sa madaling sabi, ang mga daga (may edad na 6-8 na linggo) ay na-injected (intraperitoneally [ip]) na may 2.5 ml ng 2.98% Difco liquid thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) at pinakain ng 3-4 palates.Ang isang suspensyon ng mga macrophage ay nakolekta mula sa lukab ng tiyan ng mga daga pagkatapos ng euthanasia at na-centrifuge ng 3 beses sa 1000 g para sa 10 min.Ang mga na-harvest na cell ay nakita sa pamamagitan ng daloy ng cytometry gamit ang CD11b marker hanggang sa ang kadalisayan ng cell ay> 98%, pagkatapos ay idinagdag sa 6-well cell culture plates (4.5 x 106 cells/well) at incubated na may 10% FBS (Bioindustry) sa 37°C.at 5% CO2.
Ang RNA ay nakuha mula sa 1 × 107 trophozoites sa 1 ml ng TRIzol reagent (Vazyme, Nanjing, China), ang genomic DNA ay nakuha mula sa kabuuang G. duodenalis RNA gamit ang MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) at ang pantulong na DNA (cDNA) ay na-synthesize gamit ang MonScript RTIIII Super Mix (Monad) ayon sa mga tagubilin ng gumawa.
Ang impormasyon ng pagkakasunud-sunod ng CDS para sa target na G. duodenalis gene ay nakuha mula sa NCBI GenBank.Gumamit ng Primer 5.0 para magdisenyo ng mga partikular na seamless cloning primer para sa bawat target na gene.Ang forward primer (5′-3′) ay binubuo ng tatlong bahagi: isang magkakapatong na pagkakasunud-sunod na may linearized vector pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTTCTGCAGAT) at simulan ang mga codon na ATG at GNN (kung ang unang base ay hindi G).Ginagawa ito upang mapabuti ang kahusayan ng pagpapahayag.Bilang karagdagan, hindi bababa sa 16 bp pinagsamang base (GC content 40–60%/Tm approx. 55 °C).Ang reverse primer (5′-3′) ay binubuo ng dalawang bahagi, isang magkakapatong na sequence na may EcoRV-linearized vector pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) at isang pinagsamang base na hindi bababa sa 16 bp.(hindi kasama ang huling dalawang hinto).bases) isang codon tulad ng AA o GA upang payagan ang mga recombinant plasmids na ipahayag ang kanilang mga may label na protina).Ang mga primer sequence ay nakalista sa Talahanayan 1 at na-synthesize ng Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Ang mga target ay pinalaki gamit ang Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) o Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) gamit ang inihandang G. duodenalis cDNA bilang template.Ang eukaryotic expression vector plasmid pcDNA3.1(+) ay linearized na may restriction enzyme EcoRV at dephosphorylated gamit ang Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Ang mga linearized na pcDNA3.1(+) na fragment at amplified na target na mga fragment ng gene ay nilinis gamit ang DNA gel purification kit (Tiangen) at na-quantified gamit ang Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Ang pcDNA3.1(+) fragment at bawat target na gene fragment ay muling pinagsama gamit ang MonClone single assembly cloning mix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) at kinumpirma ng DNA sequencing gamit ang Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) ..
Ang mga endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 at pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ay nabuo gamit ang SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Ang konsentrasyon ay pinananatili sa itaas 500 ng/µl upang matiyak na ang EDTA sa elution buffer ay hindi makagambala sa transfection assay.Ang pangunahing mouse peritoneal macrophage ay nilinang sa 6-well plate na may kumpletong RPMI 1640 medium (Biological Industries) sa loob ng 12 oras, pagkatapos ang mga cell ay hugasan ng 3 beses sa mainit na PBS upang alisin ang penicillin at streptomycin, at pagkatapos ay sa medium na pupunan ng kumpletong medium.Ang mga endotoxin-free plasmids na pcDNA3.1(+)-alpha-2 at pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) ay natunaw sa 125 μl ng Opti-MEM na pinababang serum medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific) ..Pagkatapos ay 5 µl ng Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ay diluted sa 125 µl ng low serum Opti-MEM medium.Maghanda ng liposome-DNA complexes sa pamamagitan ng paghahalo ng diluted na endotoxin-free plasmid sa Lipofectamine 2000 at hayaan ang mixture na tumayo sa room temperature ng 5 minuto.Ilipat ang mga complex nang hiwalay sa mga cell sa bawat balon at ihalo nang dahan-dahan.Pagkatapos ng 4 na oras, ang cell culture medium ay pinalitan ng 2 ml ng kumpletong RPMI 1640 medium at ipinagpatuloy ang kultura sa loob ng 24 na oras.Ang sariwang cell culture medium ay idinagdag sa mga cell at incubated para sa iba't ibang mga oras ng oras depende sa disenyo ng assay.
Ang mga sample ng protina mula sa mga supernatant at cell lysates ay inihanda tulad ng inilarawan dati [25].Ang mga parameter ng paglipat ng lamad para sa pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, at His-tag ay 200 mA/90 min.Para sa interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) at NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) at 1:5000 na nagta-target sa Kanyang tag ( Amylet Scientific, Wuhan, China) at β-actin (Proteintech, Wuhan, China).
Ang cross-linking na may disuccinimide suberate (DSS) ay isinagawa tulad ng inilarawan dati [26].Ang mga cell ay hugasan ng 3 beses na may malamig na PBS at ganap na na-lysed gamit ang isang 27 gauge needle sa 50 μl ASC reaction buffer (pH 8.0) na naglalaman ng 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES at 125 mM NaHCO3.Ang timpla ay na-centrifuge sa 5000 g sa loob ng 3 min at ang pellet ay tinahi ng 10 µl DSS (25 mM sa DMSO) at 40 µl ASC reaction buffer sa loob ng 30 min sa 37 ° C.Pagkatapos ng centrifugation sa 5000 g para sa 10 min, ang pellet ay natunaw sa isang solusyon ng 40 μl ng ASC reaction buffer at 10 μl ng 6x protein loading buffer (TransGen, Beijing, China), at pagkatapos ay ang solusyon ay na-quenched sa temperatura ng kuwarto para sa 15 min., Pagkatapos ay pakuluan ng 10 minuto.Ang mga sample ng protina ay isinailalim sa Western blotting gamit ang pangunahing anti-ASC antibodies (Wanleibio, Shenyang, China) sa isang dilution ratio na 1:500.
Kasunod ng isang naunang inilarawan na pamamaraan [13], ang mga supernatant ng cell culture ay na-ani at ang pagtatago ng pro-inflammatory cytokine IL-1β ay natukoy gamit ang mouse IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).I-convert ang mga halaga ng OD450nm sa mga konsentrasyon ng protina gamit ang IL-1β standard curve.
Ang mga cell na pinahiran sa mga coverlip ay malumanay na hinugasan ng 3 beses sa mainit na PBS, na naayos sa tissue cell fixative (Biosharp, Beijing, China) sa loob ng 10 min sa temperatura ng silid (RT), sa 0.1% Triton X-Permeabilize sa 100 (natunaw sa PBS; Biosharp ) sa loob ng 20 minuto sa temperatura ng silid at i-block sa 5% bovine serum albumin (sa PBS) sa loob ng 2 oras sa temperatura ng silid.Ang mga cell ay pagkatapos ay incubated magdamag sa 4 ° C na may pangunahing antibodies laban sa ASC (1:100 dilution) o NLRP3 (1:100 dilution), ayon sa pagkakabanggit, at Cy3 na may label na kambing na anti-rabbit IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) o FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (1:400; Earthox) magdamag sa 37°C sa dilim sa loob ng 1 oras.Ang nuclei ay namantsahan ng Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, China) sa loob ng 5 minuto at naobserbahan sa ilalim ng isang fluorescence microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Ang mga daga ay nahahati sa apat na grupo (n = 7 sa bawat pangkat): (i) PBS-treated na negatibong control group (PBS lamang; gavage 100 µl/mouse PBS na sinusundan ng pang-araw-araw na intraperitoneal injection 100 µl/mouse PBS 3 oras mamaya) ., tuloy-tuloy sa loob ng 7 araw);(ii) negatibong control group na ginagamot sa MCC950 inhibitor [27] (100 µl/mouse sa pamamagitan ng PBS gavage, 3 oras mamaya, 10 mg/kg body weight [BW] MCC950 [sa PBS] ay pinangangasiwaan intraperitoneally araw-araw, tagal ng 7 araw);(iii) G. duodenalis cyst infection group (1.5 x 106 cysts/mouse by gavage, 3 oras mamaya, 100 μl/mouse PBS intraperitoneally na pinangangasiwaan araw-araw sa loob ng 7 araw);(iv) G. duodenalis cyst pinagsamang grupo ng impeksyon MCC950 inhibitor na grupo ng paggamot (1.5×106 cyst/mouse sa pamamagitan ng gavage, 10mg/kg body weight MCC950 intraperitoneally araw-araw sa loob ng 7 araw sa 3h).Ang bigat ng katawan ng bawat mouse ay sinusubaybayan araw-araw at ang lahat ng mga daga ay na-euthanize sa ika-7 araw.Ang inani na duodenum (3 cm ang haba) ay pinutol sa maliliit na piraso sa 1 ml PBS, ang mga cyst ay nawasak magdamag sa PBS sa 4°C, at G. duodenalis trophozoites.Ang sariwang duodenum (1 cm ang haba) ay ibinukod para sa paglamlam ng hematoxylin at eosin (H&E).
Ang mga daga ay nahahati sa dalawang pangkat: (i) MOCK control group at (ii) MCC950 inhibitor group.Mayroong limang paggamot sa bawat grupo (n = 7/pangkat ng paggamot): (i) PBS treatment negative control group (PBS lang; 100 µl/mouse PBS, intramuscular (IM) injection (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmid negative control group (100 µg/mouse DNA, sa pamamagitan ng intramuscular injection); pangkat na ginagamot ng plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/mouse DNA, sa pamamagitan ng intramuscular injection), at (v) isang grupo na ginagamot ng plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/mouse Ang DNA, pagkatapos ng 12 oras na pagpasa, ang mga daga sa MCC950 inhibitor group ay nakatanggap ng pang-araw-araw na intraperitoneal injection ng MCC950 (10 mg/kg body weight) sa loob ng 7 araw, habang ang mga daga sa MOCK group ay nakatanggap ng pantay na dami ng PBS treatment. Ang mga sample ng dugo ay na nakolekta mula sa mga daga ng eyeballs at iniwan ng magdamag sa 4 °C na mga sample ng Serum ay nahiwalay gamit ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para sa at mga sukat ng mga antas ng IL-1β.
Tatlumpu't limang daga ang nahahati sa limang grupo (n=7/grupo).Ang pangkat 1 ay isang negatibong grupo ng kontrol na ginagamot sa PBS: ang mga daga ay nakatanggap ng 100 μl ng PBS intramuscularly at 3 araw mamaya sa pamamagitan ng gavage.Ang pangkat 2 ay isang positibong grupo ng kontrol na nahawaan ng G. duodenalis cysts: ang mga daga ay na-injected ng 100 μl ng PBS, at pagkaraan ng 3 araw, 1.5 x 106 cysts/mouse ay na-injected intragastrially.Ikatlong grupo – plasmid immunization na may pcDNA3.1(+) kasabay ng control group para sa duodenal cyst infection: ang mga daga ay nakatanggap ng 100 μg ng plasmid DNA pcDNA3.1(+)(im) pasalita, 1.5×106 cyst/mouse 3 para sa ilang araw.Ang mga pangkat 4 at 5 ay recombinant na pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid kasama ng G. duodenalis cyst infection.Pang-eksperimentong pangkat: nakatanggap ang mga daga ng 100 µg ng pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), pagkatapos makalipas ang 3 araw, 1.5 × 106 cyst/mouse ang na-injected sa pamamagitan ng gavage.Ang bigat ng katawan ng bawat mouse ay sinusubaybayan pagkatapos ng pagpapakilala ng G. duodenalis cyst sa pamamagitan ng tubo.Ang sariwang duodenum ay nakolekta para sa mga sukat ng pag-load ng parasitiko at pagsusuri sa paglamlam ng HE.
Ang mga pagbabago sa histopathological ay nasuri ayon sa isang naunang nai-publish na pamamaraan [30].Ang sariwang duodenum ay naayos na may tissue cell fixative, naka-embed sa paraffin, pinutol sa 4 μm na mga seksyon, nabahiran ng H&E at sinuri sa ilalim ng isang light microscope.Ang mga kinatawan ng pathological na pagbabago sa pitong mga seksyon ng tissue mula sa pitong independiyenteng mga daga ay nasuri ng isang pathologist na hindi alam ang paggamot at nakuha sa 200x magnification.Ang haba ng villi at ang lalim ng mga crypts ay sinusukat alinsunod sa mga naunang inilarawan na pamamaraan.
Ang mga resulta sa vitro at in vivo ay nakuha sa triplicate.Ang mga graph ay nabuo gamit ang GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng dalawang grupo ay nasuri sa pamamagitan ng t-test, habang ang mga pagkakaiba sa pagitan ng ≥3 na grupo ay sinuri ng one-way analysis of variance (ANOVA) gamit ang SPSS software (bersyon 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Sinuri ang mga datos para sa homogeneity ng variance gamit ang Levene's test na sinundan ng post hoc test ni Bonferroni (B).Ang kahalagahan ay ipinahayag bilang P<0.05, P<0.01, at P<0.001 (hindi makabuluhang [ns]) (P>0.05).
Ang aming nakaraang pagsusuri ng GEV proteomics sa Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ay nagpakita na maraming mga target ang maaaring kasangkot sa pag-activate ng mga nagpapaalab na signaling pathways [13].Pinili namin ang dalawang promising target, alpha-2 at alpha-7.3 giardins, palakasin ang mga molekula na ito at gamitin ang mga ito upang mabuo ang pcDNA3.1(+) eukaryotic expression vector.Pagkatapos ng sequencing, ang recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 at alpha-7.3 giardine expression plasmids ay inilipat sa pangunahing mouse peritoneal macrophage, at ang caspase-1 p20 signature protein ng pamamaga (isang fragment ng activated caspase-1) ay nakilala bilang elucidating key molecules na maaaring mag-trigger ng pamamaga.Ang mga resulta ay nagpakita na ang alpha-2 at alpha-7.3 giardines ay maaaring mag-udyok ng p20 caspase-1 na expression na katulad ng GEV.Walang epekto sa caspase-1 activation ang natagpuan sa hindi ginagamot na negatibong kontrol (PBS lamang) at plasmid control pcDNA3.1(+) (Larawan 1).
Pagsukat ng p20 caspase-1 activation ng pcDNA3.1(+)-alpha-2 at alpha-7.3 giardins.Ang mga recombinant na eukaryotic expression plasmids na pcDNA3.1(+)-alpha-2 at alpha-7.3 giardines (sa itaas ng bawat lane) ay inilipat sa pangunahing mouse peritoneal macrophage at ang mga supernatant ng kultura ay na-ani makalipas ang 24 na oras.Ginamit ang Western blotting upang masukat ang mga antas ng expression ng signature caspase-1 p20 inflammasome protein.Ang PBS-only treatment group (lane C) at ang pcDNA3.1(+) monotherapy group (pcDNA3.1 lane) ay ginamit bilang negatibong kontrol, at ang GEV treatment group ay ginamit bilang positibong kontrol.Ang pagpapahayag ng recombinant na protina ay nakumpirma sa pamamagitan ng pag-detect ng histidine tag sa bawat protina, at ang inaasahang mga banda ng protina ay alpha-2 giardine (38.2 kDa) at alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellular vesicle, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearized vector, SUP, supernatant
Upang matukoy kung ang alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine ay nag-uudyok ng p20 caspase-1 expression at gumaganap ng isang papel sa pag-activate ng host NLRP3 inflammatory response, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine at pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin ay inilipat sa pangunahing mouse peritoneal macrophage na may recombinant plasmid DNA, at ang mga antas ng pagpapahayag, lokalisasyon, at oligomerization ng mga pangunahing nagpapaalab na protina na NLRP3 ay natukoy.Sa eksperimentong ito, ginamit ang GEV bilang positibong control group, at ang no treatment group (PBS lang) o ang pcDNA3.1(+) transfection treatment group ay ang negatibong grupo.Ang mga resulta ay nagpakita na, tulad ng sa GEV group, ang recombinant plasmid DNA ng giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 at giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ay nagresulta sa upregulation ng NLRP3, pro-IL-1β at procaspase-1 at caspase-1 activation (Larawan 2a).Bilang karagdagan, ang parehong giardine ay nag-udyok ng makabuluhang pagtatago ng IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Larawan 2b).Karamihan sa mga protina ng ASC ay monomeric sa pangkat na walang paggamot o sa pangkat ng paggamot na inilipat gamit ang pcDNA3.1(+) plasmid, sa kaibahan sa pcDNA3.1(+)-alpha-2 o pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardine.Ang ASC oligomerization ay naganap sa recombinant plasmid DNA ng GEV positive control group o grupo, na nagpapakita ng isang oligomeric form (Larawan 2c).Iminumungkahi ng paunang data na ito na ang alpha-2 giardine at alpha-7,3 giardine ay maaaring mag-udyok sa pag-activate ng pamamaga ng NLRP3.Ang mga kasunod na immunofluorescent na pag-aaral ng lokalisasyon ng ASC at NLRP3 ay nagpakita na sa negatibong control group, ang ASC protein ay nakakalat sa buong cytoplasm at lumitaw bilang isang dot signal sa pagpapasigla ng pcDNA3.1(+)-alpha-2 na may giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7,3 giardine group o GEV positive control group (Larawan 2d).Sa negatibong kontrol at plasmid-treated na pcDNA 3.1 na grupo, ang NLRP3 protein signal ay hindi nakita, habang ang isang fluorescent signal dot bilang tugon sa pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ay nakita..Ang giardine ay matatagpuan sa cytoplasm o sa pagpapasigla ng HEV (Larawan 2e).Ang mga datos na ito ay higit pang nagpapakita na ang G. duodenalis giardin alpha-2 at giardin alpha-7.3 ay nagpapagana ng NLRP3 inflammasome sa pangunahing peritoneal macrophage ng mouse.
Ang pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin at pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ay nag-activate ng NLRP3 inflammasome sa mouse peritoneal macrophage.Ilipat ang recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin at pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin sa pangunahing murine peritoneal macrophage at mga cell, o anihin ang supernatant sa loob ng 24 h para sa pagsusuri ng expression, oligomerization , pagtatago.at lokalisasyon ng mga pangunahing nagpapasiklab na protina.Ang PBS-only (C) group at ang pcDNA3.1(+) single treatment group ay ginamit bilang negatibong kontrol, at ang GEV treatment group ay ginamit bilang positibong grupo.Ang isang pangunahing nagpapaalab na protina na NLRP3, kabilang ang NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, at p20 caspase-1, ay nakita ng Western blotting.b Ang mga antas ng pagtatago ng IL-1β sa mga supernatant ay tinutukoy gamit ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng kontrol at mga eksperimentong grupo ay nasuri sa pamamagitan ng one-way analysis of variance (ANOVA) gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga pangkat **P<0.01 at ***P<0.001.Ang mga antas ng oligomerization ng ASC sa mga pellets ay tinutukoy ng pagsusuri ng cross-linking ng DSS, habang ang mga antas ng ASC sa mga cell lysates ay ginamit bilang isang kontrol sa paglo-load.d Visualization ng ISC localization gamit ang immunofluorescence.Ginamit ang immunofluorescence upang mailarawan ang lokalisasyon ng NLRP3.ASC, apoptotic speck-like protein;IL, interleukin;NLRP3, nucleotide-binding oligomerization-like receptor 3;ns, hindi makabuluhan (P > 0.05)
Parehong G. duodenalis at ang mga GEV na inililihim nito ay nag-a-activate ng NLRP3 inflammasome at kinokontrol ang host inflammatory responses in vitro.Kaya, ang papel ng NLRP3 inflammasome sa pathogenicity ng G. duodenalis ay nananatiling hindi maliwanag.Upang imbestigahan ang isyung ito, nagdisenyo kami ng eksperimento sa pagitan ng mga daga na nahawaan ng G. duodenalis cyst at mga daga na nahawahan ng G. duodenalis cyst + paggamot sa inhibitor ng MCC950 at inihambing ang NLRP3 inflammasome expression kapag nahawahan ng G. duodenalis cyst.Ang isang detalyadong pamamaraan ng eksperimento ay ipinapakita sa Fig. 3a.Ang mga pagbabago sa timbang ng katawan ng mga daga sa iba't ibang grupo ng paggamot ay sinusubaybayan sa loob ng 7 araw pagkatapos ng impeksyon sa mga cyst, at ang mga resulta ay ipinapakita sa Fig. 3b.Kung ikukumpara sa pangkat na ginagamot ng purong PBS, ang mga resulta ay nagpakita na (i) ang timbang ng katawan ng mga daga na nahawaan ng G. duodenalis cyst ay bumaba mula sa ika-3 araw hanggang ika-7 araw pagkatapos ng impeksiyon;(ii) ang paggamot sa MCC950 inhibitor ay walang makabuluhang epekto sa bigat ng katawan ng mga daga..Kung ikukumpara sa nag-iisang grupo ng impeksiyon, ang BW ng duodenal infection group na ginagamot sa MCC950 ay bumaba sa iba't ibang antas (Araw 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Araw 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; Araw 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Araw 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175;Ipinapakita ng mga datos na ito na pinoprotektahan ng NLRP3 inflammasome ang mga daga mula sa makabuluhang pagbaba ng timbang sa mga unang yugto (2-4 na araw) ng impeksyon sa duodenal.Nilalayon namin pagkatapos na makita ang G. duodenalis trophozoites sa duodenal lavage fluid at ang mga resulta ay ipinapakita sa Figure 3c.Kung ikukumpara sa G. duodenalis cyst infection group, ang bilang ng mga trophozoites sa duodenum ay makabuluhang tumaas pagkatapos ng pagharang sa NLRP3 inflammasome (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Ang mga tisyu ng duodenal na nabahiran ng HE ay nagpakita, kumpara sa negatibong kontrol na ginagamot sa PBS at MCC950 lamang: ​​(i) Ang impeksyon sa G. duodenalis cyst ay nagresulta sa pinsala sa duodenal villi (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) at crypt atrophy (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum mula sa mga daga na nahawaan ng G. duodenalis cyst at ginagamot sa mga MCC950 inhibitors.duodenal villi ay nasira at namatay (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) na may pagkasayang at crypt branching (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f).Iminumungkahi ng mga resultang ito na ang NLRP3 inflammasome ay gumaganap ng isang papel sa pagbabawas ng pathogenicity ng G. duodenalis.
Papel ng NLRP3 inflammasome sa impeksyon sa Giardia duodenum.Ang mga daga ay na-gavaged (iv) ng mga duodenococcal cyst at pagkatapos ay ginagamot nang may o walang MCC950 (ip).Ang mga solong grupo ng paggamot na may PBS o MCC950 ay ginamit bilang mga kontrol.Pang-eksperimentong grupo at regimen ng paggamot.b Ang bigat ng katawan ng mga daga sa bawat isa sa iba't ibang mga grupo ng paggamot ay sinusubaybayan sa loob ng 7 araw.Ang pagkakaiba sa pagitan ng G. duodenalis infection group at G. duodenalis + MCC950 infection treatment group ay nasuri sa pamamagitan ng t-test gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa *P<0.05, **P<0.01, o ***P<0.001.c Parasitic load ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagbibilang ng bilang ng mga trophozoites sa duodenal lavage fluid.Ang pagkakaiba sa pagitan ng G. duodenalis infection group at G. duodenalis + MCC950 infection treatment group ay nasuri sa pamamagitan ng t-test gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa *P <0.05.d Hematoxylin at eosin (H&E) na mga resulta ng paglamlam ng duodenal histopathology.Ang mga pulang arrow ay nagpapahiwatig ng pinsala sa villi, ang mga berdeng arrow ay nagpapahiwatig ng pinsala sa mga crypts.Scale bar: 100 µm.e, f Statistical analysis ng taas ng duodenal villus at taas ng mouse crypt.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa *P<0.05 at **P<0.01.Ang mga resulta ay kinuha mula sa 7 independiyenteng biological na mga eksperimento.BW, timbang ng katawan;ig, intragastric na ruta ng paghahatid;ip, intraperitoneal na ruta ng paghahatid;ns, hindi makabuluhan (P > 0.05);PBS, phosphate buffered saline;WT, wild type
Ang pagtatago ng IL-1β ay isang tanda ng pag-activate ng pamamaga.Upang matukoy kung ang G. duodenalis alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine ay nag-activate ng NLRP3 host inflammasome sa vivo, gumamit kami ng hindi ginagamot na WT mice (sham group) at NLRP3 inflammasome-blocked na mice (MCC950 inhibited treatment group).Ang isang detalyadong pamamaraan ng eksperimento ay ipinapakita sa Fig. 4a.Ang mga eksperimental na grupo ay binubuo ng mga daga na ginagamot ng PBS, G. duodenalis cyst na paggamot sa pamamagitan ng gavage, intramuscular injection ng pcDNA3.1, at intramuscular injection ng pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Sa ika-7 araw pagkatapos ng intramuscular administration ng recombinant plasmid, nakolekta ang serum at natukoy ang antas ng IL-1β sa bawat pangkat.Tulad ng ipinapakita sa Figure 4b, sa MOCK group: (i) kumpara sa PBS group, ang pcDNA3.1 na paggamot ay walang makabuluhang epekto sa pagtatago ng IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), gayunpaman, Ang pagtatago ng IL-β ay makabuluhang nakataas sa G. duodenalis cyst group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine at pcDNA3.1- Ang intramuscular injection ng alpha-7.3 giardine ay makabuluhang tumaas ng serum IL-1β na antas (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine induced mataas na antas ng IL -1β secretion sa pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Kung ikukumpara sa bawat grupo sa MCC950 treatment group at MOCK group: (i) IL-1β secretion level sa PBS control group at pcDNA3.1 control group ay nabawasan sa isang tiyak na lawak matapos i-block ang MCC950 inhibitor, ngunit ang pagkakaiba ay hindi makabuluhan (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) pagkatapos harangan ang MCC950., ang pagtatago ng IL-1β ay makabuluhang nabawasan sa G. duodenalis cyst-infected group, ang pcDNA3.1-alpha-2 giardine group, at ang pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine group (G. duodenalis: ANOVA, F(9). , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164).Iminumungkahi ng mga resultang ito na ang alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine ay namamagitan sa pag-activate ng NLRP3 inflammasome sa vivo.
Ina-activate ng pcDNA3.1(+)-giardines ang NLRP3 host inflammasome sa vivo.Ang mga daga ay nabakunahan (IM) ng recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine at pagkatapos ay ginagamot sa MCC950 (ip; MCC950 group) o hindi (dummy group). ).Ang PBS o pcDNA3.1(+) plasmid treatment group ay ginamit bilang isang negatibong kontrol, ang G. duodenalis cyst treatment group ay ginamit bilang isang positibong kontrol.Pang-eksperimentong grupo at regimen ng paggamot.b Ang mga antas ng serum ng IL-1β sa mga daga ay sinusukat sa ika-7 araw ng ELISA assay.Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo sa MOCK group ay nasuri gamit ang one-way ANOVA, at ang mga pagkakaiba sa pagitan ng MOCK group at MCC950 group ay nasuri gamit ang t-test ng SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo ng paggamot sa MOCK group, * P<0.05 at *** P<0.001;ang mga palatandaan ng dolyar ($) ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng bawat grupo sa MOCK group at ng MCC950 group sa P<0.05.Mga resulta ng pitong independiyenteng biological na eksperimento.i, intramuscular injection, ns, hindi makabuluhan (P > 0.05)
Upang imbestigahan ang epekto ng alpha-2 at alpha-7.3 giardine-mediated activation ng NLRP3 host inflammasome sa G. duodenalis infectivity, ginamit namin ang WT C57BL/6 mice at nag-inject ng alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine.ang plasmid ay na-injected intramuscularly, pagkatapos ng 3 araw sa pamamagitan ng gastric tube ng G. duodenalis cyst, pagkatapos nito ang mga daga ay sinusunod sa loob ng 7 araw.Ang isang detalyadong pamamaraan ng eksperimento ay ipinapakita sa Fig. 5a.Ang bigat ng katawan ng bawat mouse ay sinusukat araw-araw, ang mga sample ng sariwang duodenal tissue ay nakolekta sa ika-7 araw pagkatapos ng pangangasiwa sa pamamagitan ng gastric tube, ang bilang ng mga trophozoites ay sinusukat, at ang mga pagbabago sa histopathological ay sinusunod.Tulad ng ipinapakita sa Figure 5b, sa pagtaas ng oras ng pagpapakain, ang BW ng mga daga sa bawat pangkat ay unti-unting tumaas.Ang MT ng mga daga ay nagsimulang bumaba sa ika-3 araw pagkatapos ng intragastric administration ng G. duodenalis cysts, at pagkatapos ay unti-unting tumaas.Ang pag-activate ng NLRP3 inflammasome na sapilitan ng intramuscular injection ng alpha-2 giardine at alpha7.3 giardine ay makabuluhang pinahina ang pagbaba ng timbang sa mga daga (Day 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Araw 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Araw 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Araw 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Day 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 Day 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Day 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Day 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Day 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Day 6: pcDNA3 . alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Day 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Araw 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Day 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Ang parasitic load ay nasuri sa duodenum (Larawan 5c).Kung ikukumpara sa hindi ginagamot na positibong kontrol at ang grupong na-injected ng walang laman na pcDNA3.1 vector, ang bilang ng G. duodenalis trophozoites ay makabuluhang nabawasan sa mga grupong na-injected ng α-2 giardine at α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Bilang karagdagan, ang giardine alfa-7.3 ay mas proteksiyon sa mga daga kaysa sa giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Ang mga resulta ng HE staining ay ipinapakita sa fig.5d–f.Ang mga daga na na-injected ng alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine ay may mas kaunting duodenal tissue lesions, na ipinakita ng villus damage, kumpara sa mga daga na na-injected ng G. duodenalis at mga mice na na-injected ng G. duodenalis kasabay ng isang walang laman na pcDNA3 vector .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 o P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 o P = 0.0055) at nabawasan ang crypt atrophy (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 o P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 o P = 0.0191).Iminumungkahi ng mga resultang ito na binabawasan ng alpha-2 giardine at alpha-7,3 giardine ang infectivity ng G. duodenalis sa pamamagitan ng pag-activate ng NLRP3 inflammasome sa vivo.
Tungkulin ng pcDNA3.1(+)-giardins sa impeksyon ng G. duodenalis.Ang mga daga ay nabakunahan (IM) ng recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine at pagkatapos ay hinamon ng G. duodenalis cysts (ig).Ang PBS group at ang pcDNA3.1(+) + duodenal cyst treatment group ay ginamit bilang negatibong control group, at ang duodenal cyst treatment group ay ginamit bilang positive control group.Pang-eksperimentong grupo at regimen ng paggamot.b Ang MT ng mga daga sa bawat isa sa iba't ibang mga grupo ng paggamot ay sinusubaybayan sa loob ng 7 araw na post-challenge.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo sa G. duodenalis group at ng pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine group, *P <0.05, **P <0.01, at ***P <0.001;ang dollar sign ($) ay nagpapahiwatig ng makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng bawat pangkat ng G. duodenalis at ng pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine group, $$P<0.01 at $$$P<0.001.c Parasitic load ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagbibilang ng bilang ng mga trophozoites sa 1 ml ng duodenal lavage mula sa duodenum (3 cm ang haba) at ipinahayag bilang bilang ng mga parasito sa bawat cm ng duodenum.Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng G. duodenalis infection group, ang pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine group, at ang pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine group ay sinuri ng one-way ANOVA gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa **P<0.01 at ***P<0.001.d Mga pagbabago sa histopathological sa duodenum.Ang mga pulang arrow ay nagpapahiwatig ng pinsala sa villi, ang mga berdeng arrow ay nagpapahiwatig ng pinsala sa mga crypts.Scale bar: 100 µm.e, f Statistical analysis ng mouse duodenal villus height (e) at crypt height (f).Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo sa Figure 1d ay sinuri ng one-way ANOVA gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa *P<0.05 at **P<0.01.Mga resulta ng pitong independiyenteng biological na eksperimento.ns, hindi makabuluhan (P > 0.05)
Ang Giardia duodenum ay isang kilalang intestinal parasite ng mga tao at iba pang mammal na nagdudulot ng giardiasis.Noong 2004, isinama ito sa WHO Neglected Diseases Initiative dahil sa mataas na prevalence nito sa loob ng 6 na taon, lalo na sa mga komunidad na mababa ang socioeconomic status [32].Ang likas na immune system ay gumaganap ng isang kritikal na papel sa immune tugon sa G. duodenalis impeksyon.Ang mga macrophage ng mouse ay naiulat na nilalamon at pinapatay ang G. duodenalis sa pamamagitan ng pagpapakawala ng mga extracellular traps [33].Ipinakita ng aming mga nakaraang pag-aaral na ang G. duodenalis, isang non-invasive extracellular parasite, ay nag-a-activate ng p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, at NLRP3 inflammatory signaling pathways sa mouse macrophage upang i-regulate ang host inflammatory response, at ang inilabas na GEV ay maaaring mapahusay ang prosesong ito.13], 24].Gayunpaman, ang eksaktong mga PAMP na kasangkot sa pamamaga ng NLRP3 inflammasome-regulated sa GEV at ang papel ng NLRP3 inflammasome sa giardiasis ay nananatiling ipaliwanag.Upang bigyang liwanag ang dalawang tanong na ito, isinagawa namin ang pag-aaral na ito.
Ang NLRP3 inflammasome ay matatagpuan sa cytoplasm ng immune cells at maaaring i-activate ng iba't ibang particle tulad ng mga kristal ng uric acid, toxins, bacteria, virus, at parasito.Sa mga pag-aaral ng bakterya, ang mga toxin ay nakilala bilang mga pangunahing PAMP na nagpapagana ng mga nagpapaalab na sensor, na humahantong sa pamamaga at pagkamatay ng cell [34].Ang ilang structurally diverse toxins, tulad ng hemolysin mula sa Staphylococcus aureus [35] at Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) mula sa enterotoxin (NHE) [37], ay nag-udyok sa pag-activate ng pamamaga ng NLRP3.Ipinakita ng mga viral na pag-aaral na ang mga virulence protein tulad ng SARS-COV-2 envelope (E) protein [38] at Zika virus NS5 protein [39] ay mahahalagang PAMP na kinikilala ng NLRP3 receptor.Sa pag-aaral ng mga parasito, maraming mga parasito ang naiulat na nauugnay sa host inflammasome activation, tulad ng Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], at Leishmania [42].Ang mga siksik na butil na protina na GRA35, GRA42, at GRA43, na nauugnay sa virulence ng Toxoplasma gondii, ay kinakailangan para sa induction ng pyroptosis sa Lewis rat macrophage [43].Bilang karagdagan, ang ilang mga pag-aaral sa Leishmania ay nakatuon sa mga indibidwal na molekula na kasangkot sa NLRP3 inflammasome, tulad ng parasite membrane lipophosphoglycan [44] o zinc metalloprotease [45].Kabilang sa annexin-like alpha-giardin family of genes, alpha-1 giardin ay ipinakita na isang potensyal na kandidato sa bakuna na nagbibigay ng proteksyon laban sa G. duodenalis sa isang mouse model [18].Sa aming pag-aaral, pinili namin ang G. duodenalis virulence factor alpha-2 at alpha-7,3 giardines, na kakaiba sa giardia ngunit medyo hindi gaanong naiulat.Ang dalawang target na gen na ito ay na-clone sa pcDNA3.1(+) eukaryotic expression system vector para sa pagsusuri ng pag-activate ng pamamaga.
Sa aming modelo ng mouse, ang mga cleaved caspase fragment ay nagsisilbing marker ng inflammatory activation.Sa stimulation, nakikipag-ugnayan ang NLRP3 sa ASC, nagre-recruit ng mga procaspase, at bumubuo ng mga aktibong caspases na nag-cleave sa pro-IL-1β at pro-IL-18 sa mature na IL-1β at IL-18, ayon sa pagkakabanggit -18.Ang mga inflammatory caspases (caspases-1, -4, -5 at -11) ay isang conserved na pamilya ng cysteine ​​​​protease na kritikal para sa likas na depensa at kasangkot sa pamamaga at programmed cell death [46].Ang Caspase-1 ay isinaaktibo ng mga canonical inflammasomes [47], habang ang caspases-4, -5, at -11 ay pinuputol sa panahon ng pagbuo ng mga hindi tipikal na pamamaga [48].Sa pag-aaral na ito, ginamit namin ang mouse peritoneal macrophage bilang isang modelo at sinisiyasat ang p20 caspase-1 na nag-cleaved caspase-1 bilang isang marker ng host NLRP3 inflammation activation sa mga pag-aaral ng G. duodenalis infection.Ipinakita ng mga resulta na maraming mga alpha-giardin ang may pananagutan para sa tipikal na pag-activate ng pamamaga, na naaayon sa pagtuklas ng mga pangunahing molekula ng virulence na kasangkot sa bakterya at mga virus.Gayunpaman, ang aming pag-aaral ay isang paunang screen lamang at may iba pang mga molekula na maaaring mag-activate ng mga hindi klasikal na pamamaga, dahil ang aming nakaraang pag-aaral ay natagpuan ang parehong mga klasikal at hindi klasikal na pamamaga sa G. duodenalis infection [13].Upang higit pang matukoy kung ang nabuong p20 caspase-1 ay nauugnay sa NLRP3 inflammasome, inilipat namin ang alpha-2 at alpha-7.3 giardins sa mouse peritoneal macrophage upang matukoy ang mga pangunahing antas ng expression ng protina ng molekula at mga antas ng oligomerization ng ASC, na nagpapatunay na ang parehong α-giardins ay aktibo. inflammasome NLRP3.Ang aming mga resulta ay bahagyang naiiba mula sa Manko-Prykhoda et al., na nag-ulat na ang pagpapasigla ng mga Caco-2 na mga cell na may G. muris o E. coli EPEC strains lamang ay maaaring mapataas ang fluorescence intensity ng NLRP3, ASC, at caspase-1, bagaman hindi makabuluhang, habang kung paano nadagdagan ng costimulation ng G. muris at E. coli ang mga antas ng tatlong protina [49].Ang pagkakaibang ito ay maaaring dahil sa mga pagkakaiba sa pagpili ng Giardia species, cell line, at pangunahing mga cell.Nagsagawa rin kami ng in vivo assays gamit ang MCC950 sa 5-linggong babaeng WT C57BL/6 na daga, na mas madaling kapitan sa G. duodenalis.Ang MCC950 ay isang makapangyarihan at pumipili na maliit na molecule na NLRP3 inhibitor na humaharang sa canonical at non-canonical NLRP3 activation sa nanomolar concentrations.Pinipigilan ng MCC950 ang pag-activate ng NLRP3 ngunit hindi nakakaapekto sa pag-activate ng AIM2, NLRC4, at NLRP1 inflammatory pathways o TLR signaling pathways [27].Hinaharangan ng MCC950 ang pag-activate ng NLRP3 ngunit hindi pinipigilan ang pagsisimula ng NLRP3, K+ efflux, Ca2+ influx, o ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng NLRP3 at ASC;sa halip, pinipigilan nito ang NLRP3 inflammasome activation sa pamamagitan ng pagharang sa ASC oligomerization [27].Samakatuwid, ginamit namin ang MCC950 sa isang in vivo na pag-aaral upang matukoy ang papel ng NLRP3 inflammasome pagkatapos ng giardine injection.Ang activated caspase-1 p10 ay tinatanggal ang mga pro-inflammatory cytokine na pro-IL-1β at pro-IL-18 sa mature na IL-1β at IL-18 [50].Sa pag-aaral na ito, ang mga antas ng serum na IL-1β sa mga daga na ginagamot sa giardine na may o walang MCC950 ay ginamit bilang isang tagapagpahiwatig kung ang NLRP3 inflammasome ay naisaaktibo.Tulad ng inaasahan, ang paggamot sa MCC950 ay makabuluhang nabawasan ang mga antas ng serum IL-1β.Ang mga datos na ito ay malinaw na nagpapakita na ang G. duodenalis giardin alfa-2 at giardin alfa-7.3 ay nakakapag-activate ng NLRP3 mouse inflammasome.
Ang makabuluhang data na naipon sa nakalipas na dekada ay nagpakita na ang IL-17A ay ang master regulator ng immunity laban sa G. muris, na nag-uudyok sa IL-17RA signaling, gumagawa ng mga antimicrobial peptides, at nagre-regulate ng complement activation [51].Gayunpaman, ang impeksyon ng Giardia ay nangyayari nang mas madalas sa mga kabataan, at naiulat na ang impeksyon ng Giardia sa mga batang daga ay hindi nag-aaktibo sa tugon ng IL-17A upang maisagawa ang proteksiyon na epekto nito [52], na nag-udyok sa mga mananaliksik na maghanap ng iba pang immunomodulatory Giardia.Mga mekanismo ng impeksyon sa helminth.Ang mga may-akda ng isang kamakailang pag-aaral ay nag-ulat na ang G. muris ay maaaring i-activate ang NLRP3 inflammasome ng E. coli EPEC, na nagtataguyod ng produksyon ng mga antimicrobial peptides at binabawasan ang kapasidad ng attachment nito at ang bilang ng mga trophozoites sa bituka, sa gayon ay binabawasan ang kalubhaan ng colon mga sakit na dulot ng bacilli [49].Ang NLRP3 inflammasome ay kasangkot sa pagbuo ng iba't ibang sakit.Ipinakita ng mga pag-aaral na ang Pseudomonas aeruginosa ay nag-trigger ng autophagy sa mga macrophage upang maiwasan ang pagkamatay ng cell, at ang prosesong ito ay nakasalalay sa pag-activate ng NLRP3 inflammasome [53].Para sa N. caninum, nililimitahan ng reactive oxygen species-mediated activation ng NLRP3 inflammasome ang pagtitiklop nito sa host, na ginagawa itong potensyal na therapeutic target [9].Ang Paracoccidioides brasiliensis ay natagpuan na mag-udyok sa pag-activate ng NLRP3 inflammasome sa mga dendritic cells na nagmula sa bone marrow ng mouse, na nagreresulta sa pagpapakawala ng nagpapaalab na cytokine IL-1β, na gumaganap ng isang kritikal na papel sa pagtatanggol ng host [10].Maraming Leishmania species, kabilang ang L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, at L. infantum chagasi, ang nag-activate ng NLRP3 at ASC-dependent caspase-1 sa mga macrophage, gayundin ang impeksyon sa Leishmania.Ang pagtitiklop ng parasito ay pinahusay sa mga daga na kulang sa NLRP3/ASC/caspase-1 gene [11].Zamboni et al.Ang impeksyon sa Leishmania ay naiulat na mag-udyok sa pag-activate ng NLRP3 inflammasome sa macrophage, na naglilimita sa intracellular parasite replication.Kaya, maaaring pigilan ng Leishmania ang pag-activate ng NLRP3 bilang isang diskarte sa pag-iwas.Sa mga pag-aaral sa vivo, ang NLRP3 inflammasome ay nag-ambag sa pag-aalis ng Leishmania, ngunit hindi nakakaapekto sa mga tisyu [54].Sa kabaligtaran, sa mga pag-aaral ng helminthiasis, ang pag-activate ng NLRP3 inflammasome ay pinigilan ang proteksiyon na kaligtasan sa sakit ng host laban sa gastrointestinal helminthiasis [12].Ang Shigella ay isa sa mga pangunahing bacteria na nagdudulot ng pagtatae sa buong mundo.Ang mga bacteria na ito ay maaaring mag-udyok ng produksyon ng IL-1β sa pamamagitan ng P2X7 receptor-mediated K+ efflux, reactive oxygen species, lysosomal acidification, at mitochondrial damage.Ang NLRP3 inflammasome ay negatibong kinokontrol ang phagocytosis at bactericidal na aktibidad ng mga macrophage laban sa Shigella [55].Ipinakita ng mga pag-aaral sa Plasmodium na ang AIM2, NLRP3 o caspase-1 na kulang sa mga daga na nahawaan ng Plasmodium ay gumagawa ng mataas na antas ng type 1 interferon at mas lumalaban sa impeksyon ng Plasmodium [56].Gayunpaman, ang papel ng alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine sa pag-udyok sa pathogenic activation ng pamamaga ng NLRP3 sa mga daga ay hindi malinaw.
Sa pag-aaral na ito, ang pagsugpo sa NLRP3 inflammasome ng MCC950 ay nabawasan ang BW at nadagdagan ang bilang ng mga trophozoites sa intestinal lavage fluid sa mga daga, na nagreresulta sa mas matinding pagbabago sa pathological sa duodenal tissue.Ang Alpha-2 giardine at alpha-7.3 giardine ay nag-activate ng host mouse na NLRP3 inflammasome, nagpapataas ng timbang ng katawan ng mouse, binabawasan ang bilang ng mga trophozoites sa intestinal lavage fluid, at nagpapagaan ng mga pathological duodenal lesions.Iminumungkahi ng mga resultang ito na maaaring i-activate ng G. duodenalis ang host inflammasome ng NLRP3 sa pamamagitan ng alpha-2 giardine at alpha-7,3 giardine, na binabawasan ang pathogenicity ng G. duodenalis sa mga daga.
Sama-sama, ipinapakita ng aming mga resulta na ang alpha-2 at alpha-7.3 giardine ay nag-uudyok sa pag-activate ng host ng NLRP3 na pamamaga at binabawasan ang pagkahawa ng G. duodenalis sa mga daga.Samakatuwid, ang mga molekulang ito ay nangangako ng mga target para sa pag-iwas sa giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: isang pangkalahatang-ideya.Kamakailan ay nabunyag na si Pat Inflamm ay allergic sa droga.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: isang pagsusuri ng pharmacotherapy.Opinyon ng Dalubhasa ng isang parmasyutiko.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, paglaban sa droga at ang pagtuklas ng mga bagong target.Nakakahawa sa mga target na gamot sa Disorder.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, atbp. NLRP3 inflammasome at nagpapaalab na sakit.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ang papel ng inflammasome sa pamamaga ng bituka at kanser.Gastroenterology.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical at atypical NLRP3 inflammasome activation sa sangang-daan ng immune tolerance at pamamaga ng bituka.pre-immune.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Ang ROS-mediated NLRP3 inflammasome activation ay kasangkot bilang tugon sa N. caninum infection.Vektor ng parasito.2020;13:449.