Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang mga vector ng gene para sa paggamot ng pulmonary cystic fibrosis ay dapat na naka-target sa conductive airways, dahil ang peripheral lung transduction ay walang therapeutic effect.Ang kahusayan ng viral transduction ay direktang nauugnay sa oras ng paninirahan ng carrier.Gayunpaman, ang mga likido sa paghahatid tulad ng mga carrier ng gene ay natural na kumakalat sa alveoli sa panahon ng paglanghap, at ang mga therapeutic particle ng anumang hugis ay mabilis na inaalis ng mucociliary transport.Ang pagpapalawak ng oras ng paninirahan ng mga gene carrier sa respiratory tract ay mahalaga ngunit mahirap makamit.Ang mga carrier-conjugated magnetic particle na maaaring idirekta sa ibabaw ng respiratory tract ay maaaring mapabuti ang pag-target sa rehiyon.Dahil sa mga problema sa in vivo imaging, ang pag-uugali ng naturang maliliit na magnetic particle sa ibabaw ng daanan ng hangin sa pagkakaroon ng isang inilapat na magnetic field ay hindi gaanong nauunawaan.Ang layunin ng pag-aaral na ito ay gumamit ng synchrotron imaging upang mailarawan sa vivo ang paggalaw ng isang serye ng mga magnetic particle sa trachea ng mga anesthetized na daga upang pag-aralan ang dynamics at pattern ng pag-uugali ng single at bulk particle sa vivo.Sinuri din namin kung ang paghahatid ng mga lentiviral magnetic particle sa pagkakaroon ng isang magnetic field ay tataas ang kahusayan ng transduction sa trachea ng daga.Ipinapakita ng Synchrotron X-ray imaging ang pag-uugali ng mga magnetic particle sa nakatigil at gumagalaw na magnetic field sa vitro at in vivo.Ang mga particle ay hindi madaling i-drag sa ibabaw ng mga buhay na daanan ng hangin gamit ang mga magnet, ngunit sa panahon ng transportasyon, ang mga deposito ay puro sa larangan ng view, kung saan ang magnetic field ay pinakamalakas.Ang kahusayan ng transduction ay tumaas din ng anim na beses kapag ang mga lentiviral magnetic particle ay inihatid sa pagkakaroon ng isang magnetic field.Kung sama-sama, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang mga lentiviral magnetic particle at magnetic field ay maaaring mahalagang mga diskarte upang mapabuti ang pag-target ng gene vector at mga antas ng transduction sa mga conductive airways sa vivo.
Ang cystic fibrosis (CF) ay sanhi ng mga pagkakaiba-iba sa isang gene na tinatawag na CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Ang CFTR protein ay isang ion channel na naroroon sa maraming epithelial cells sa buong katawan, kabilang ang mga daanan ng hangin, isang pangunahing lugar sa pathogenesis ng cystic fibrosis.Ang mga depekto sa CFTR ay humahantong sa abnormal na transportasyon ng tubig, dehydration ng ibabaw ng daanan ng hangin, at pagbaba ng lalim ng airway surface fluid (ASL).Pinipigilan din nito ang kakayahan ng mucociliary transport (MCT) system na linisin ang mga daanan ng hangin ng mga nilalanghap na particle at pathogens.Ang aming layunin ay bumuo ng isang lentiviral (LV) gene therapy upang maihatid ang tamang kopya ng CFTR gene at mapabuti ang ASL, MCT, at kalusugan ng baga, at upang magpatuloy sa pagbuo ng mga bagong teknolohiya na maaaring masukat ang mga parameter na ito sa vivo1.
Ang mga LV vectors ay isa sa mga nangungunang kandidato para sa cystic fibrosis gene therapy, pangunahin dahil maaari nilang permanenteng isama ang therapeutic gene sa mga basal cell ng daanan ng hangin (airway stem cells).Ito ay mahalaga dahil maaari nilang ibalik ang normal na hydration at mucus clearance sa pamamagitan ng pagkakaiba-iba sa mga functional na gene-corrected airway surface cells na nauugnay sa cystic fibrosis, na nagreresulta sa panghabambuhay na mga benepisyo.Ang mga LV vector ay dapat na nakadirekta laban sa mga conductive airways, dahil dito nagsisimula ang paglahok ng baga sa CF.Ang paghahatid ng vector na mas malalim sa baga ay maaaring magresulta sa alveolar transduction, ngunit ito ay walang therapeutic effect sa cystic fibrosis.Gayunpaman, ang mga likido tulad ng mga carrier ng gene ay natural na lumilipat sa alveoli kapag nalalanghap pagkatapos ng panganganak3,4 at ang mga therapeutic na particle ay mabilis na pinalalabas sa oral cavity ng mga MCT.Ang kahusayan ng LV transduction ay direktang nauugnay sa haba ng oras na ang vector ay nananatiling malapit sa mga target na cell upang payagan ang cellular uptake - "oras ng paninirahan" 5 na madaling paikliin ng tipikal na regional airflow pati na rin ang coordinated uptake ng mucus at MCT particle.Para sa cystic fibrosis, ang kakayahang pahabain ang oras ng paninirahan ng LV sa mga daanan ng hangin ay mahalaga upang makamit ang mataas na antas ng transduction sa lugar na ito, ngunit sa ngayon ay naging mahirap.
Upang malampasan ang hadlang na ito, iminumungkahi namin na ang mga LV magnetic particle (MP) ay makakatulong sa dalawang pantulong na paraan.Una, maaari silang gabayan ng magnet sa ibabaw ng daanan ng hangin upang mapabuti ang pag-target at tulungan ang mga particle ng carrier ng gene na nasa tamang lugar ng daanan ng hangin;at ASL) ay lumipat sa cell layer 6. Ang mga MP ay malawakang ginagamit bilang mga target na sasakyan sa paghahatid ng gamot kapag sila ay nagbubuklod sa mga antibodies, chemotherapy na gamot, o iba pang maliliit na molekula na nakakabit sa mga lamad ng cell o nagbubuklod sa kani-kanilang mga cell surface receptor at naipon sa mga tumor site sa pagkakaroon ng static na kuryente.Magnetic field para sa cancer therapy 7. Ang iba pang "hyperthermic" na pamamaraan ay naglalayong patayin ang mga selula ng tumor sa pamamagitan ng pag-init ng mga MP kapag nalantad sa mga oscillating magnetic field.Ang prinsipyo ng magnetic transfection, kung saan ang magnetic field ay ginagamit bilang isang transfection agent upang mapahusay ang paglipat ng DNA sa mga cell, ay karaniwang ginagamit sa vitro gamit ang isang hanay ng mga non-viral at viral gene vectors para sa mahirap-transduce na mga linya ng cell ..Ang kahusayan ng LV magnetotransfection kasama ang paghahatid ng LV MP in vitro sa isang cell line ng human bronchial epithelium sa pagkakaroon ng isang static magnetic field ay itinatag, na nagdaragdag ng kahusayan ng transduction ng 186 beses kumpara sa LV vector lamang.Ang LV MT ay inilapat din sa isang in vitro na modelo ng cystic fibrosis, kung saan ang magnetic transfection ay nadagdagan ang LV transduction sa air-liquid interface culture sa pamamagitan ng isang factor na 20 sa pagkakaroon ng cystic fibrosis sputum10.Gayunpaman, sa vivo organ magnetotransfection ay nakatanggap ng medyo maliit na pansin at nasuri lamang sa ilang mga pag-aaral ng hayop11,12,13,14,15, lalo na sa baga16,17.Gayunpaman, ang mga posibilidad ng magnetic transfection sa lung therapy sa cystic fibrosis ay malinaw.Tan et al.(2020) ay nagsabi na "isang validation study sa epektibong pulmonary delivery ng magnetic nanoparticle ay magbibigay daan para sa hinaharap na CFTR inhalation strategies upang mapabuti ang klinikal na resulta sa mga pasyenteng may cystic fibrosis"6.
Ang pag-uugali ng mga maliliit na magnetic particle sa ibabaw ng respiratory tract sa pagkakaroon ng isang inilapat na magnetic field ay mahirap na maisalarawan at pag-aralan, at samakatuwid ang mga ito ay hindi gaanong naiintindihan.Sa iba pang mga pag-aaral, nakagawa kami ng Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) na pamamaraan para sa non-invasive imaging at quantification ng minuto sa mga pagbabago sa vivo sa ASL18 depth at MCT19 behavior,20 para direktang masukat ang gas channel surface hydration at ginagamit bilang isang maagang tagapagpahiwatig ng pagiging epektibo ng paggamot.Bilang karagdagan, ang aming paraan ng pagmamarka ng MCT ay gumagamit ng 10–35 µm diameter na mga particle na binubuo ng alumina o mataas na refractive index glass bilang MCT marker na nakikita sa PB-PCXI21.Ang parehong mga pamamaraan ay angkop para sa imaging ng isang hanay ng mga uri ng butil, kabilang ang mga MP.
Dahil sa mataas na spatial at temporal na resolution, ang aming PB-PCXI-based na ASL at MCT assay ay angkop na pag-aralan ang dynamics at behavioral pattern ng single at bulk particle sa vivo para matulungan kaming maunawaan at ma-optimize ang mga paraan ng paghahatid ng MP gene.Ang diskarte na ginagamit namin dito ay batay sa aming mga pag-aaral gamit ang SPring-8 BL20B2 beamline, kung saan na-visualize namin ang paggalaw ng likido pagkatapos ng paghahatid ng isang dosis ng isang dummy vector sa mga daanan ng ilong at pulmonary ng mga daga upang makatulong na ipaliwanag ang aming mga heterogenous na pattern ng expression ng gene na naobserbahan. sa gene natin.pag-aaral ng hayop na may carrier na dosis na 3.4 .
Ang layunin ng pag-aaral na ito ay gamitin ang PB-PCXI synchrotron upang mailarawan sa vivo ang mga paggalaw ng isang serye ng mga MP sa trachea ng mga live na daga.Ang mga pag-aaral sa imaging ng PB-PCXI na ito ay idinisenyo upang subukan ang serye ng MP, lakas ng magnetic field, at lokasyon upang matukoy ang kanilang epekto sa paggalaw ng MP.Ipinapalagay namin na ang isang panlabas na magnetic field ay makakatulong sa naihatid na MF na manatili o lumipat sa target na lugar.Ang mga pag-aaral na ito ay nagpapahintulot din sa amin na matukoy ang mga kumpigurasyon ng magnet na nagpapalaki sa dami ng mga particle na natitira sa trachea pagkatapos ng deposition.Sa pangalawang serye ng mga pag-aaral, nilalayon naming gamitin ang pinakamainam na pagsasaayos na ito upang ipakita ang transduction pattern na nagreresulta mula sa in vivo na paghahatid ng mga LV-MP sa mga daanan ng daga, sa pag-aakalang magreresulta ang paghahatid ng mga LV-MP sa konteksto ng pag-target sa daanan ng hangin. sa tumaas na kahusayan ng transduction ng LV..
Ang lahat ng pag-aaral ng hayop ay isinagawa alinsunod sa mga protocol na inaprubahan ng University of Adelaide (M-2019-060 at M-2020-022) at ng SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Ang mga eksperimento ay isinagawa alinsunod sa mga rekomendasyon ng ARRIVE.
Ang lahat ng mga x-ray na imahe ay kinuha sa BL20XU beamline sa SPring-8 synchrotron sa Japan gamit ang isang setup na katulad ng inilarawan dati21,22.Sa madaling sabi, ang experimental box ay matatagpuan 245 m mula sa synchrotron storage ring.Ang isang sample-to-detector na distansya na 0.6 m ay ginagamit para sa particle imaging studies at 0.3 m para sa in vivo imaging studies upang lumikha ng mga phase contrast effect.Isang monochromatic beam na may enerhiya na 25 keV ang ginamit.Ang mga imahe ay nakuha gamit ang isang mataas na resolution X-ray transducer (SPring-8 BM3) na isinama sa isang sCMOS detector.Ang transducer ay nagko-convert ng mga X-ray sa nakikitang liwanag gamit ang isang 10 µm makapal na scintillator (Gd3Al2Ga3O12), na pagkatapos ay nakadirekta sa sCMOS sensor gamit ang isang ×10 (NA 0.3) na layunin ng mikroskopyo.Ang sCMOS detector ay isang Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) na may array size na 2048 × 2048 pixels at isang raw pixel size na 6.5 × 6.5 µm.Ang setting na ito ay nagbibigay ng epektibong isotropic na laki ng pixel na 0.51 µm at isang field ng view na humigit-kumulang 1.1 mm × 1.1 mm.Ang tagal ng pagkakalantad na 100 ms ay pinili upang i-maximize ang signal-to-noise ratio ng mga magnetic particle sa loob at labas ng mga daanan ng hangin habang pinapaliit ang mga artifact ng paggalaw na dulot ng paghinga.Para sa mga pag-aaral sa vivo, isang mabilis na X-ray shutter ang inilagay sa X-ray path upang limitahan ang dosis ng radiation sa pamamagitan ng pagharang sa X-ray beam sa pagitan ng mga exposure.
Hindi ginamit ang LV media sa anumang SPring-8 PB-PCXI imaging studies dahil ang BL20XU imaging chamber ay hindi Biosafety Level 2 certified.Sa halip, pumili kami ng isang hanay ng mga mahusay na nailalarawan na MP mula sa dalawang komersyal na vendor na sumasaklaw sa isang hanay ng mga sukat, materyales, konsentrasyon ng bakal, at mga aplikasyon , — una upang maunawaan kung paano nakakaapekto ang mga magnetic field sa paggalaw ng mga MP sa mga glass capillaries, at pagkatapos ay sa buhay na daanan ng hangin.ibabaw.Ang laki ng MP ay nag-iiba mula 0.25 hanggang 18 µm at ginawa mula sa iba't ibang materyales (tingnan ang Talahanayan 1), ngunit ang komposisyon ng bawat sample, kabilang ang laki ng mga magnetic particle sa MP, ay hindi alam.Batay sa aming malawak na pag-aaral sa MCT 19, 20, 21, 23, 24, inaasahan namin na ang mga MP hanggang 5 µm ay makikita sa ibabaw ng tracheal airway, halimbawa, sa pamamagitan ng pagbabawas ng magkakasunod na mga frame upang makita ang pinahusay na visibility ng paggalaw ng MP.Ang nag-iisang MP na 0.25 µm ay mas maliit kaysa sa resolution ng imaging device, ngunit inaasahang matutuklasan ng PB-PCXI ang kanilang volumetric na contrast at ang paggalaw ng likido sa ibabaw kung saan sila idineposito pagkatapos ideposito.
Mga sample para sa bawat MP sa talahanayan.1 ay inihanda sa 20 μl glass capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) na may panloob na diameter na 0.63 mm.Ang mga corpuscular particle ay available sa tubig, habang ang CombiMag particle ay available sa proprietary liquid ng manufacturer.Ang bawat tubo ay kalahating puno ng likido (humigit-kumulang 11 µl) at inilagay sa sample holder (tingnan ang Larawan 1).Ang mga capillaries ng salamin ay inilagay nang pahalang sa entablado sa silid ng imaging, ayon sa pagkakabanggit, at nakaposisyon sa mga gilid ng likido.Isang 19 mm diameter (28 mm ang haba) na nickel-shell magnet na gawa sa rare earth, neodymium, iron at boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) na may remanence na 1.17 T ay nakakabit sa isang hiwalay na talahanayan ng paglilipat upang makamit ang Malayuang baguhin ang iyong posisyon habang nagre-render.Ang X-ray imaging ay nagsisimula kapag ang magnet ay nakaposisyon nang humigit-kumulang 30 mm sa itaas ng sample at ang mga imahe ay nakuha sa 4 na mga frame bawat segundo.Sa panahon ng imaging, ang magnet ay inilapit sa glass capillary tube (sa layo na humigit-kumulang 1 mm) at pagkatapos ay inilipat kasama ang tubo upang masuri ang epekto ng lakas at posisyon ng field.
Isang in vitro imaging setup na naglalaman ng mga sample ng MP sa mga glass capillaries sa yugto ng pagsasalin ng xy sample.Ang landas ng X-ray beam ay minarkahan ng pulang tuldok na linya.
Kapag naitatag na ang in vitro visibility ng mga MP, isang subset ng mga ito ang nasubok sa vivo sa mga wild-type na babaeng Wistar albino na daga (~12 linggong gulang, ~200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) at butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ang mga daga ay na-anesthetize gamit ang Pharma (Japan) mixture sa pamamagitan ng intraperitoneal injection.Pagkatapos ng anesthesia, inihanda sila para sa imaging sa pamamagitan ng pag-alis ng balahibo sa paligid ng trachea, pagpasok ng endotracheal tube (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), at i-immobilize ang mga ito sa nakahiga na posisyon sa isang custom-made imaging plate na naglalaman ng thermal bag. upang mapanatili ang temperatura ng katawan.22. Ang imaging plate ay pagkatapos ay naka-attach sa sample stage sa imaging box sa isang bahagyang anggulo upang ihanay ang trachea nang pahalang sa x-ray na imahe tulad ng ipinapakita sa Figure 2a.
(a) In vivo imaging setup sa SPring-8 imaging unit, X-ray beam path na minarkahan ng pulang tuldok na linya.( b, c ) Ang lokalisasyon ng tracheal magnet ay isinagawa nang malayuan gamit ang dalawang orthogonally mounted IP camera.Sa kaliwang bahagi ng larawan sa screen, makikita mo ang wire loop na humahawak sa ulo at ang delivery cannula na naka-install sa loob ng ET tube.
Isang remote controlled syringe pump system (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gamit ang 100 µl glass syringe ay ikinonekta sa isang PE10 tubing (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) gamit ang 30 Ga needle.Markahan ang tubo upang matiyak na ang dulo ay nasa tamang posisyon sa trachea kapag ipinapasok ang endotracheal tube.Gamit ang micropump, inalis ang syringe plunger at ang dulo ng tubo ay inilubog sa MP sample na ihahatid.Ang load na delivery tube ay ipinasok sa endotracheal tube, inilalagay ang dulo sa pinakamalakas na bahagi ng aming inaasahang inilapat na magnetic field.Ang pagkuha ng imahe ay kinokontrol gamit ang isang breath detector na konektado sa aming Arduino-based na timing box, at lahat ng signal (hal., temperatura, paghinga, shutter open/close, at image acquisition) ay naitala gamit ang Powerlab at LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Kapag Imaging Kapag hindi available ang housing, dalawang IP camera (Panasonic BB-SC382) ay nakaposisyon sa humigit-kumulang 90° sa isa't isa at ginamit upang kontrolin ang posisyon ng magnet na may kaugnayan sa trachea sa panahon ng imaging (Figure 2b, c).Upang mabawasan ang mga artifact ng paggalaw, isang imahe sa bawat paghinga ang nakuha sa panahon ng terminal respiratory flow plateau.
Ang magnet ay nakakabit sa ikalawang yugto, na maaaring malayuan na matatagpuan sa labas ng katawan ng imaging.Sinuri ang iba't ibang posisyon at configuration ng magnet, kabilang ang: inilagay sa isang anggulo na humigit-kumulang 30° sa itaas ng trachea (ipinapakita ang mga configuration sa Figures 2a at 3a);isang magnet sa itaas ng hayop at ang isa sa ibaba, na may mga poste na nakatakda para sa pang-akit (Figure 3b)., isang magnet sa itaas ng hayop at isa sa ibaba, na may mga poste na nakatakda para sa pagtanggi (Figure 3c), at isang magnet sa itaas at patayo sa trachea (Figure 3d).Pagkatapos i-set up ang hayop at magnet at i-load ang MP sa ilalim ng pagsubok sa syringe pump, maghatid ng dosis na 50 µl sa bilis na 4 µl/sec sa pagkuha ng mga imahe.Ang magnet ay pagkatapos ay inilipat pabalik-balik sa kahabaan o sa kabila ng trachea habang patuloy na kumukuha ng mga imahe.
Configuration ng magnet para sa in vivo imaging (a) isang magnet sa itaas ng trachea sa isang anggulo na humigit-kumulang 30°, (b) dalawang magnet na na-configure para sa pang-akit, (c) dalawang magnet na na-configure para sa repulsion, (d) isang magnet sa itaas at patayo sa trachea.Ang nagmamasid ay tumingin pababa mula sa bibig hanggang sa baga sa pamamagitan ng trachea at ang X-ray beam ay dumaan sa kaliwang bahagi ng daga at lumabas sa kanang bahagi.Ang magnet ay maaaring ilipat sa kahabaan ng daanan ng hangin o kaliwa at kanan sa itaas ng trachea sa direksyon ng X-ray beam.
Sinikap din naming matukoy ang visibility at pag-uugali ng mga particle sa mga daanan ng hangin sa kawalan ng paghahalo ng paghinga at rate ng puso.Samakatuwid, sa pagtatapos ng panahon ng imaging, ang mga hayop ay humanely euthanized dahil sa labis na dosis ng pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Ang ilang mga hayop ay naiwan sa platform ng imaging, at pagkatapos ng paghinto ng paghinga at tibok ng puso, ang proseso ng imaging ay naulit, na nagdaragdag ng karagdagang dosis ng MP kung walang MP na nakikita sa ibabaw ng daanan ng hangin.
Ang mga nagresultang imahe ay naitama para sa patag at madilim na larangan at pagkatapos ay pinagsama sa isang pelikula (20 mga frame bawat segundo; 15-25 × normal na bilis depende sa rate ng paghinga) gamit ang isang pasadyang script na nakasulat sa MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ang lahat ng mga pag-aaral sa paghahatid ng LV gene vector ay isinagawa sa University of Adelaide Laboratory Animal Research Center at naglalayong gamitin ang mga resulta ng eksperimento sa SPring-8 upang masuri kung ang paghahatid ng LV-MP sa pagkakaroon ng magnetic field ay maaaring mapahusay ang paglipat ng gene sa vivo .Upang suriin ang mga epekto ng MF at magnetic field, dalawang grupo ng mga hayop ang ginagamot: ang isang grupo ay na-injected ng LV MF na may magnet placement, at ang iba pang grupo ay na-injected ng control group na may LV MF na walang magnet.
Ang mga LV gene vectors ay nabuo gamit ang naunang inilarawan na mga pamamaraan 25, 26 .Ang LacZ vector ay nagpapahayag ng isang nuclear localized beta-galactosidase gene na hinimok ng MPSV constitutive promoter (LV-LacZ), na gumagawa ng asul na produkto ng reaksyon sa mga transduced na cell, na nakikita sa mga harapan at mga seksyon ng tissue ng baga.Ang titration ay isinagawa sa mga cell culture sa pamamagitan ng manu-manong pagbibilang ng bilang ng mga LacZ-positive na mga cell gamit ang isang hemocytometer upang kalkulahin ang titer sa TU/ml.Ang mga carrier ay cryopreserve sa -80°C, natunaw bago gamitin, at itinatali sa CombiMag sa pamamagitan ng paghahalo ng 1:1 at pag-incubate sa yelo nang hindi bababa sa 30 minuto bago ang paghahatid.
Normal na mga daga ng Sprague Dawley (n = 3/grupo, ~2-3 anesthetized ip na may pinaghalong 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) at 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) sa 1 buwang edad) ip ) iniksyon at non-surgical oral cannulation na may 16 Ga intravenous cannula.Upang matiyak na ang tracheal airway tissue ay tumatanggap ng LV transduction, ito ay nakondisyon gamit ang aming naunang inilarawan na mechanical perturbation protocol kung saan ang ibabaw ng tracheal airway ay pinunasan ng axially gamit ang wire basket (N-Circle, nitinol stone extractor na walang tip NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Pagkatapos, mga 10 minuto pagkatapos ng perturbation sa biosafety cabinet, isinagawa ang tracheal administration ng LV-MP.
Ang magnetic field na ginamit sa eksperimentong ito ay na-configure nang katulad sa isang in vivo x-ray na pag-aaral, na may parehong magnet na hawak sa ibabaw ng trachea na may mga distillation stent clamp (Larawan 4).Isang 50 µl volume (2 x 25 µl aliquots) ng LV-MP ang inihatid sa trachea (n = 3 hayop) gamit ang isang gel-tipped pipette tulad ng inilarawan dati.Ang control group (n = 3 hayop) ay nakatanggap ng parehong LV-MP nang hindi gumagamit ng magnet.Matapos makumpleto ang pagbubuhos, ang cannula ay tinanggal mula sa endotracheal tube at ang hayop ay pinalabas.Ang magnet ay nananatili sa lugar para sa 10 minuto bago alisin.Ang mga daga ay na-dosed subcutaneously na may meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) na sinundan ng anesthesia withdrawal sa pamamagitan ng intraperitoneal injection ng 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Ang mga daga ay pinananatiling mainit at sinusunod hanggang sa kumpletong paggaling mula sa kawalan ng pakiramdam.
LV-MP delivery device sa isang biological safety cabinet.Makikita mo na ang mapusyaw na kulay abong Luer-lock na manggas ng ET tube ay nakausli mula sa bibig, at ang gel pipette tip na ipinapakita sa figure ay ipinasok sa pamamagitan ng ET tube sa nais na lalim sa trachea.
Isang linggo pagkatapos ng pamamaraan ng pangangasiwa ng LV-MP, ang mga hayop ay makataong isinakripisyo sa pamamagitan ng paglanghap ng 100% CO2 at ang ekspresyon ng LacZ ay nasuri gamit ang aming karaniwang X-gal na paggamot.Ang tatlong pinaka-caudal cartilage ring ay tinanggal upang matiyak na ang anumang mekanikal na pinsala o pagpapanatili ng likido dahil sa paglalagay ng endotracheal tube ay hindi isasama sa pagsusuri.Ang bawat trachea ay pinutol nang pahaba upang makakuha ng dalawang halves para sa pagsusuri at inilagay sa isang tasa na naglalaman ng silicone rubber (Sylgard, Dow Inc) gamit ang isang Minutien needle (Fine Science Tools) upang mailarawan ang luminal surface.Ang pamamahagi at katangian ng mga transduced na cell ay nakumpirma ng frontal photography gamit ang isang Nikon microscope (SMZ1500) na may isang DigiLite camera at TCapture software (Tucsen Photonics, China).Nakuha ang mga larawan sa 20x magnification (kabilang ang maximum na setting para sa buong lapad ng trachea), na ang buong haba ng trachea ay ipinapakita nang sunud-sunod, na nagbibigay ng sapat na overlap sa pagitan ng bawat larawan upang payagan ang mga larawan na "magtahi".Ang mga imahe mula sa bawat trachea ay pinagsama sa isang solong pinagsama-samang imahe gamit ang Composite Image Editor bersyon 2.0.3 (Microsoft Research) gamit ang planar motion algorithm. Ang lugar ng LacZ expression sa loob ng tracheal composite na mga imahe mula sa bawat hayop ay binibilang gamit ang isang awtomatikong MATLAB script (R2020a, MathWorks) tulad ng naunang inilarawan28, gamit ang mga setting ng 0.35 <Hue <0.58, Saturation > 0.15, at Value <0.7. Ang lugar ng LacZ expression sa loob ng tracheal composite na mga imahe mula sa bawat hayop ay binibilang gamit ang isang awtomatikong MATLAB script (R2020a, MathWorks) tulad ng naunang inilarawan28, gamit ang mga setting ng 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, at Value < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Ang lugar ng LacZ expression sa pinagsama-samang mga imahe ng tracheal mula sa bawat hayop ay binibilang gamit ang isang awtomatikong MATLAB script (R2020a, MathWorks) tulad ng inilarawan dati28 gamit ang mga setting ng 0.350.15 at halaga<0 .7.如 前所 述 ， 使用 自动 MATLAB 脚本 （R2020A ， MATHWORKS） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 lacz 表达 区域 进行 量化 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.7 的 设置。。如 前所 述 ， 自动 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A ， MATHWORKS） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 使用 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的 。。。。。 。。。。。 .. . . . . . . . . . . Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Ang mga lugar ng LacZ expression sa pinagsama-samang mga imahe ng trachea ng bawat hayop ay binibilang gamit ang isang awtomatikong MATLAB script (R2020a, MathWorks) tulad ng inilarawan dati gamit ang mga setting ng 0.35 < hue < 0.58, saturation > 0.15 at value < 0.7 .Sa pamamagitan ng pagsubaybay sa mga contour ng tissue sa GIMP v2.10.24, manu-manong ginawa ang mask para sa bawat pinagsama-samang larawan upang matukoy ang bahagi ng tissue at maiwasan ang anumang maling pagtuklas sa labas ng tracheal tissue.Ang mga lugar na may mantsa mula sa lahat ng pinagsama-samang mga imahe mula sa bawat hayop ay summed upang ibigay ang kabuuang lugar na may mantsa para sa hayop na iyon.Ang lugar na pininturahan ay hinati sa kabuuang lugar ng maskara upang makakuha ng isang normal na lugar.
Ang bawat trachea ay naka-embed sa paraffin at pinaghati-hatian ng 5 µm ang kapal.Ang mga seksyon ay na-counterstain ng neutral na mabilis na pula sa loob ng 5 minuto at ang mga imahe ay nakuha gamit ang isang Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 camera at NIS element capture software (bersyon 5.20.00).
Ang lahat ng mga pagsusuri sa istatistika ay isinagawa sa GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Ang kahalagahan ng istatistika ay itinakda sa p ≤ 0.05.Ang normalidad ay nasubok gamit ang Shapiro-Wilk test at ang mga pagkakaiba sa LacZ staining ay nasuri gamit ang isang unpaired t-test.
Ang anim na MP na inilarawan sa Talahanayan 1 ay sinuri ng PCXI, at ang visibility ay inilarawan sa Talahanayan 2. Dalawang polystyrene MP (MP1 at MP2; 18 µm at 0.25 µm, ayon sa pagkakabanggit) ay hindi nakikita ng PCXI, ngunit ang natitirang mga sample ay maaaring makilala (Ang mga halimbawa ay ipinapakita sa Figure 5).Ang MP3 at MP4 ay mahinang nakikita (10-15% Fe3O4; 0.25 µm at 0.9 µm, ayon sa pagkakabanggit).Bagama't ang MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) ay naglalaman ng ilan sa mga pinakamaliit na particle na nasubok, ito ang pinakamatingkad.Ang produkto ng CombiMag MP6 ay mahirap makilala.Sa lahat ng mga kaso, ang aming kakayahang makita ang mga MF ay lubos na napabuti sa pamamagitan ng paglipat ng magnet pabalik-balik parallel sa capillary.Habang lumalayo ang mga magnet mula sa capillary, ang mga particle ay nahugot sa mahabang kadena, ngunit habang lumalapit ang mga magnet at tumaas ang lakas ng magnetic field, ang mga particle chain ay umikli habang ang mga particle ay lumipat patungo sa itaas na ibabaw ng capillary (tingnan ang Supplemental Video S1 : MP4), pagtaas ng density ng butil sa ibabaw.Sa kabaligtaran, kapag ang magnet ay tinanggal mula sa capillary, ang lakas ng field ay bumababa at ang mga MP ay muling nagsasaayos sa mahabang chain na umaabot mula sa itaas na ibabaw ng capillary (tingnan ang Karagdagang Video S2: MP4).Matapos huminto sa paggalaw ang magnet, ang mga particle ay patuloy na gumagalaw nang ilang oras pagkatapos maabot ang posisyon ng equilibrium.Habang ang MP ay gumagalaw patungo at palayo sa itaas na ibabaw ng capillary, ang mga magnetic particle ay may posibilidad na gumuhit ng mga labi sa pamamagitan ng likido.
Malaki ang pagkakaiba ng visibility ng MP sa ilalim ng PCXI sa pagitan ng mga sample.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 at (d) MP6.Ang lahat ng mga imahe na ipinakita dito ay kinuha gamit ang isang magnet na nakaposisyon nang humigit-kumulang 10 mm nang direkta sa itaas ng capillary.Ang maliwanag na malalaking bilog ay mga bula ng hangin na nakulong sa mga capillary, na malinaw na nagpapakita ng itim at puting mga tampok ng gilid ng phase contrast na imahe.Ang pulang kahon ay nagpapahiwatig ng pagpapalaki na nagpapahusay sa kaibahan.Tandaan na ang mga diameter ng magnet circuit sa lahat ng mga figure ay hindi sukat at humigit-kumulang 100 beses na mas malaki kaysa sa ipinapakita.
Habang ang magnet ay gumagalaw pakaliwa at pakanan sa tuktok ng capillary, ang anggulo ng MP string ay nagbabago upang ihanay sa magnet (tingnan ang Figure 6), kaya naglalarawan ng mga linya ng magnetic field.Para sa MP3-5, pagkatapos maabot ng chord ang anggulo ng threshold, ang mga particle ay nag-drag sa itaas na ibabaw ng capillary.Madalas itong nagreresulta sa pag-cluster ng mga MP sa mas malalaking grupo malapit sa kung saan pinakamalakas ang magnetic field (tingnan ang Karagdagang Video S3: MP5).Ito rin ay lalo na nakikita kapag ang imaging malapit sa dulo ng capillary, na nagiging sanhi ng MP na magsama-sama at mag-concentrate sa interface ng likido-hangin.Ang mga particle sa MP6, na mas mahirap makilala kaysa sa mga nasa MP3-5, ay hindi nag-drag kapag gumagalaw ang magnet sa kahabaan ng capillary, ngunit ang mga string ng MP ay naghiwalay, na iniiwan ang mga particle sa view (tingnan ang Karagdagang Video S4: MP6).Sa ilang mga kaso, kapag ang inilapat na magnetic field ay nabawasan sa pamamagitan ng paggalaw ng magnet sa isang mahabang distansya mula sa imaging site, anumang natitirang mga MP ay dahan-dahang bumaba sa ilalim na ibabaw ng tubo sa pamamagitan ng gravity, na nananatili sa string (tingnan ang Karagdagang Video S5: MP3) .
Ang anggulo ng MP string ay nagbabago habang ang magnet ay gumagalaw sa kanan sa itaas ng capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 at (d) MP6.Ang pulang kahon ay nagpapahiwatig ng pagpapalaki na nagpapahusay sa kaibahan.Pakitandaan na ang mga karagdagang video ay para sa mga layuning pang-impormasyon habang nagpapakita ang mga ito ng mahalagang istraktura ng particle at dynamic na impormasyon na hindi makikita sa mga static na larawang ito.
Ipinakita ng aming mga pagsubok na ang paggalaw ng magnet pabalik-balik sa kahabaan ng trachea ay nagpapadali sa visualization ng MF sa konteksto ng kumplikadong paggalaw sa vivo.Walang mga pagsubok sa vivo ang isinagawa dahil ang mga polystyrene beads (MP1 at MP2) ay hindi nakikita sa capillary.Ang bawat isa sa natitirang apat na MF ay sinubukan sa vivo na may mahabang axis ng magnet na nakaposisyon sa ibabaw ng trachea sa isang anggulo na humigit-kumulang 30° sa patayo (tingnan ang Mga Figure 2b at 3a), dahil nagresulta ito sa mas mahabang MF chain at mas epektibo. kaysa sa magnet..winakasan ang pagsasaayos.Ang MP3, MP4 at MP6 ay hindi natagpuan sa trachea ng anumang buhay na hayop.Kapag nakikita ang respiratory tract ng mga daga pagkatapos ng makataong pagpatay sa mga hayop, ang mga particle ay nanatiling hindi nakikita kahit na ang karagdagang dami ay idinagdag gamit ang isang syringe pump.Ang MP5 ay may pinakamataas na nilalaman ng iron oxide at ang tanging nakikitang particle, kaya ginamit ito upang suriin at tukuyin ang pag-uugali ng MP sa vivo.
Ang paglalagay ng magnet sa ibabaw ng trachea sa panahon ng pagpasok ng MF ay nagresulta sa marami, ngunit hindi lahat, ang mga MF ay puro sa larangan ng pagtingin.Ang pagpasok ng tracheal ng mga particle ay pinakamahusay na naobserbahan sa makataong euthanized na mga hayop.Figure 7 at Karagdagang Video S6: Ang MP5 ay nagpapakita ng mabilis na magnetic capture at alignment ng mga particle sa ibabaw ng ventral trachea, na nagpapahiwatig na ang mga MP ay maaaring i-target sa mga gustong lugar ng trachea.Kapag naghahanap ng mas malayo sa kahabaan ng trachea pagkatapos ng paghahatid ng MF, ang ilang mga MF ay natagpuan na mas malapit sa carina, na nagpapahiwatig ng hindi sapat na lakas ng magnetic field upang kolektahin at hawakan ang lahat ng mga MF, dahil ang mga ito ay inihatid sa rehiyon ng pinakamataas na lakas ng magnetic field sa panahon ng pangangasiwa ng likido.proseso.Gayunpaman, ang mga konsentrasyon ng postnatal MP ay mas mataas sa paligid ng lugar ng imahe, na nagmumungkahi na maraming mga MP ang nanatili sa mga rehiyon ng daanan ng hangin kung saan ang inilapat na lakas ng magnetic field ay pinakamataas.
Mga larawan ng (a) bago at (b) pagkatapos ng paghahatid ng MP5 sa trachea ng isang kamakailang na-euthanized na daga na may magnet na nakalagay sa itaas lamang ng lugar ng imaging.Ang itinatanghal na lugar ay matatagpuan sa pagitan ng dalawang cartilaginous ring.Mayroong ilang likido sa mga daanan ng hangin bago maihatid ang MP.Ang pulang kahon ay nagpapahiwatig ng pagpapalaki na nagpapahusay sa kaibahan.Ang mga larawang ito ay kinuha mula sa video na itinampok sa S6: MP5 Karagdagang Video.
Ang paglipat ng magnet sa kahabaan ng trachea sa vivo ay nagresulta sa isang pagbabago sa anggulo ng chain ng MP sa ibabaw ng daanan ng hangin, katulad ng naobserbahan sa mga capillary (tingnan ang Larawan 8 at Karagdagang Video S7: MP5).Gayunpaman, sa aming pag-aaral, ang mga MP ay hindi maaaring i-drag sa ibabaw ng mga buhay na respiratory tract, tulad ng magagawa ng mga capillary.Sa ilang mga kaso, ang MP chain ay humahaba habang ang magnet ay gumagalaw pakaliwa at kanan.Kapansin-pansin, nalaman din namin na ang particle chain ay nagbabago sa lalim ng surface layer ng fluid kapag ang magnet ay inilipat nang pahaba sa kahabaan ng trachea, at lumalawak kapag ang magnet ay direktang inilipat sa itaas at ang particle chain ay pinaikot sa isang vertical na posisyon (tingnan ang Karagdagang Video S7).: MP5 sa 0:09, kanang ibaba).Ang katangian ng pattern ng paggalaw ay nagbago kapag ang magnet ay inilipat sa gilid sa tuktok ng trachea (ibig sabihin, sa kaliwa o kanan ng hayop, sa halip na sa kahabaan ng trachea).Ang mga particle ay malinaw pa ring nakikita sa kanilang paggalaw, ngunit nang alisin ang magnet mula sa trachea, ang mga dulo ng mga string ng particle ay naging nakikita (tingnan ang Karagdagang Video S8: MP5, simula sa 0:08).Sumasang-ayon ito sa naobserbahang pag-uugali ng magnetic field sa ilalim ng pagkilos ng isang inilapat na magnetic field sa isang glass capillary.
Mga halimbawang larawan na nagpapakita ng MP5 sa trachea ng isang live na anesthetized na daga.(a) Ginagamit ang magnet upang makakuha ng mga imahe sa itaas at sa kaliwa ng trachea, pagkatapos (b) pagkatapos ilipat ang magnet sa kanan.Ang pulang kahon ay nagpapahiwatig ng pagpapalaki na nagpapahusay sa kaibahan.Ang mga larawang ito ay mula sa video na itinampok sa Pandagdag na Video ng S7: MP5.
Kapag ang dalawang poste ay nakatutok sa hilaga-timog na oryentasyon sa itaas at ibaba ng trachea (ibig sabihin, nakakaakit; Fig. 3b), ang mga MP chords ay lumitaw nang mas mahaba at matatagpuan sa lateral wall ng trachea kaysa sa dorsal surface ng trachea (tingnan ang Appendix).Video S9:MP5).Gayunpaman, ang mataas na konsentrasyon ng mga particle sa isang site (ibig sabihin, ang dorsal surface ng trachea) ay hindi nakita pagkatapos ng fluid administration gamit ang dual magnet device, na kadalasang nangyayari sa isang magnet device.Pagkatapos, kapag ang isang magnet ay na-configure upang itaboy ang magkasalungat na mga pole (Figure 3c), ang bilang ng mga particle na nakikita sa larangan ng view ay hindi tumaas pagkatapos ng paghahatid.Ang pagse-set up ng dalawang magnet configuration ay mahirap dahil sa mataas na lakas ng magnetic field na umaakit o nagtutulak sa mga magnet ayon sa pagkakabanggit.Ang setup ay binago sa isang solong magnet na kahanay sa mga daanan ng hangin ngunit dumadaan sa mga daanan ng hangin sa isang 90 degree na anggulo upang ang mga linya ng puwersa ay tumawid sa tracheal wall nang orthogonally (Larawan 3d), isang oryentasyon na nilayon upang matukoy ang posibilidad ng pagsasama-sama ng particle sa ang lateral wall.maobserbahan.Gayunpaman, sa pagsasaayos na ito, walang nakikilalang MF accumulation movement o magnet movement.Batay sa lahat ng mga resultang ito, ang isang pagsasaayos na may isang solong magnet at isang 30-degree na oryentasyon ay pinili para sa mga pag-aaral sa vivo ng mga carrier ng gene (Larawan 3a).
Kapag ang hayop ay kinunan ng larawan ng maraming beses kaagad pagkatapos na makataong isinakripisyo, ang kawalan ng nakakasagabal na paggalaw ng tissue ay nangangahulugan na ang mas pino, mas maiikling mga linya ng particle ay maaaring makita sa malinaw na intercartilaginous field, 'pag-ugoy' alinsunod sa translational motion ng magnet.malinaw na nakikita ang presensya at paggalaw ng mga partikulo ng MP6.
Ang titer ng LV-LacZ ay 1.8 x 108 IU/mL, at pagkatapos ng paghahalo ng 1:1 sa CombiMag MP (MP6), ang mga hayop ay na-injected ng 50 μl ng tracheal dose na 9 x 107 IU/ml ng LV na sasakyan (ibig sabihin 4.5 x 106 TU/daga).)).Sa mga pag-aaral na ito, sa halip na ilipat ang magnet sa panahon ng paggawa, inayos namin ang magnet sa isang posisyon upang matukoy kung ang LV transduction ay maaaring (a) mapabuti kumpara sa paghahatid ng vector sa kawalan ng magnetic field, at (b) kung ang daanan ng hangin ay maaaring maging nakatutok.Ang mga cell na inilipat sa magnetic target na lugar ng upper respiratory tract.
Ang pagkakaroon ng mga magnet at ang paggamit ng CombiMag kasama ng mga LV vectors ay hindi lumilitaw na negatibong nakakaapekto sa kalusugan ng hayop, tulad ng ginawa ng aming karaniwang LV vector delivery protocol.Ang mga frontal na larawan ng tracheal region na sumailalim sa mechanical perturbation (Karagdagang Larawan 1) ay nagpakita na ang LV-MP na ginagamot na grupo ay may makabuluhang mas mataas na antas ng transduction sa pagkakaroon ng magnet (Fig. 9a).Isang maliit na halaga lamang ng asul na paglamlam ng LacZ ang naroroon sa control group (Larawan 9b).Ang dami ng X-Gal-stained normalized na mga rehiyon ay nagpakita na ang pangangasiwa ng LV-MP sa pagkakaroon ng magnetic field ay nagresulta sa humigit-kumulang 6 na beses na pagpapabuti (Fig. 9c).
Halimbawa ng mga composite na larawan na nagpapakita ng tracheal transduction na may LV-MP (a) sa pagkakaroon ng magnetic field at (b) sa kawalan ng magnet.(c) Istatistikong makabuluhang pagpapabuti sa normalized na lugar ng LacZ transduction sa trachea sa paggamit ng magnet (*p = 0.029, t-test, n = 3 bawat grupo, mean ± standard error ng mean).
Ang mga neutral na mabilis na red-stained na seksyon (halimbawa na ipinakita sa Karagdagang Fig. 2) ay nagpahiwatig na ang mga cell na may mantsa ng LacZ ay naroroon sa parehong sample at sa parehong lokasyon tulad ng naunang naiulat.
Ang pangunahing hamon sa airway gene therapy ay nananatiling tumpak na lokalisasyon ng mga particle ng carrier sa mga lugar ng interes at ang pagkamit ng isang mataas na antas ng transduction efficiency sa mobile lung sa pagkakaroon ng airflow at aktibong mucus clearance.Para sa mga carrier ng LV na nilayon para sa paggamot ng mga sakit sa paghinga sa cystic fibrosis, ang pagtaas ng oras ng paninirahan ng mga particle ng carrier sa mga conductive airway ay hanggang ngayon ay isang hindi matamo na layunin.Tulad ng itinuro ni Castellani et al., ang paggamit ng mga magnetic field upang mapahusay ang transduction ay may mga pakinabang sa iba pang mga paraan ng paghahatid ng gene tulad ng electroporation dahil maaari itong pagsamahin ang pagiging simple, ekonomiya, naisalokal na paghahatid, pagtaas ng kahusayan, at mas maikling oras ng pagpapapisa ng itlog.at posibleng mas mababang dosis ng sasakyan10.Gayunpaman, sa vivo deposition at pag-uugali ng mga magnetic particle sa mga daanan ng hangin sa ilalim ng impluwensya ng panlabas na magnetic forces ay hindi kailanman inilarawan, at sa katunayan ang kakayahan ng pamamaraang ito upang mapataas ang mga antas ng expression ng gene sa buo na buhay na mga daanan ng hangin ay hindi naipakita sa vivo.
Ang aming mga in vitro na eksperimento sa PCXI synchrotron ay nagpakita na ang lahat ng mga particle na sinubukan namin, maliban sa MP polystyrene, ay makikita sa imaging setup na ginamit namin.Sa pagkakaroon ng isang magnetic field, ang mga magnetic field ay bumubuo ng mga string, ang haba nito ay nauugnay sa uri ng mga particle at ang lakas ng magnetic field (ibig sabihin, ang kalapitan at paggalaw ng magnet).Tulad ng ipinapakita sa Figure 10, ang mga string na aming naobserbahan ay nabuo habang ang bawat indibidwal na particle ay nagiging magnetized at nag-uudyok ng sarili nitong lokal na magnetic field.Ang mga hiwalay na field na ito ay nagiging sanhi ng iba pang katulad na mga particle upang mangolekta at kumonekta sa mga paggalaw ng string ng grupo dahil sa mga lokal na puwersa mula sa mga lokal na puwersa ng pang-akit at pagtanggi ng iba pang mga particle.
Ang diagram na nagpapakita ng (a, b) mga kadena ng mga particle na nabubuo sa loob ng mga capillary na puno ng likido at (c, d) isang trachea na puno ng hangin.Tandaan na ang mga capillary at trachea ay hindi iginuhit sa sukat.Ang panel (a) ay naglalaman din ng isang paglalarawan ng MF na naglalaman ng mga particle ng Fe3O4 na nakaayos sa mga chain.
Kapag ang magnet ay lumipat sa ibabaw ng capillary, ang anggulo ng particle string ay umabot sa kritikal na threshold para sa MP3-5 na naglalaman ng Fe3O4, pagkatapos nito ang particle string ay hindi na nanatili sa orihinal nitong posisyon, ngunit inilipat sa ibabaw sa isang bagong posisyon.magnet.Ang epektong ito ay malamang na nangyayari dahil ang ibabaw ng glass capillary ay sapat na makinis upang payagan ang paggalaw na ito na mangyari.Kapansin-pansin, ang MP6 (CombiMag) ay hindi kumilos sa ganitong paraan, marahil dahil ang mga particle ay mas maliit, may ibang coating o surface charge, o ang proprietary carrier fluid ay nakaapekto sa kanilang kakayahang lumipat.Ang kaibahan sa imahe ng particle ng CombiMag ay mas mahina din, na nagmumungkahi na ang likido at mga particle ay maaaring magkaroon ng parehong density at samakatuwid ay hindi madaling lumipat patungo sa isa't isa.Ang mga particle ay maaari ring makaalis kung ang magnet ay gumagalaw nang masyadong mabilis, na nagpapahiwatig na ang lakas ng magnetic field ay hindi palaging madaig ang friction sa pagitan ng mga particle sa likido, na nagmumungkahi na ang lakas ng magnetic field at ang distansya sa pagitan ng magnet at ang target na lugar ay hindi dapat dumating bilang isang sorpresa.mahalaga.Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig din na kahit na ang mga magnet ay nakakakuha ng maraming microparticle na dumadaloy sa target na lugar, hindi malamang na ang mga magnet ay maaaring umasa upang ilipat ang mga particle ng CombiMag sa ibabaw ng trachea.Kaya, napagpasyahan namin na sa mga pag-aaral ng vivo LV MF ay dapat gumamit ng mga static na magnetic field upang pisikal na ma-target ang mga partikular na lugar ng puno ng daanan ng hangin.
Kapag naihatid na ang mga particle sa katawan, mahirap silang tukuyin sa konteksto ng kumplikadong gumagalaw na tissue ng katawan, ngunit ang kanilang kakayahan sa pagtuklas ay napabuti sa pamamagitan ng paglipat ng magnet nang pahalang sa ibabaw ng trachea upang "i-wiggle" ang mga string ng MP.Bagama't posible ang real-time na imaging, mas madaling matukoy ang paggalaw ng butil pagkatapos mapatay ang hayop.Ang mga konsentrasyon ng MP ay karaniwang pinakamataas sa lokasyong ito kapag ang magnet ay nakaposisyon sa ibabaw ng lugar ng imaging, bagama't ang ilang mga particle ay karaniwang matatagpuan sa ibaba ng trachea.Hindi tulad ng in vitro studies, ang mga particle ay hindi maaaring hilahin pababa sa trachea sa pamamagitan ng paggalaw ng magnet.Ang paghahanap na ito ay pare-pareho sa kung paano ang mucus na sumasaklaw sa ibabaw ng trachea ay karaniwang nagpoproseso ng mga nilalanghap na particle, na nakulong ang mga ito sa mucus at pagkatapos ay nililinis ang mga ito sa pamamagitan ng muco-ciliary clearance mechanism.
Ipinagpalagay namin na ang paggamit ng mga magnet sa itaas at ibaba ng trachea para sa pang-akit (Fig. 3b) ay maaaring magresulta sa isang mas pare-parehong magnetic field, sa halip na isang magnetic field na lubos na puro sa isang punto, na posibleng magresulta sa isang mas pare-parehong pamamahagi ng mga particle..Gayunpaman, ang aming paunang pag-aaral ay hindi nakahanap ng malinaw na ebidensya upang suportahan ang hypothesis na ito.Katulad nito, ang pagtatakda ng isang pares ng mga magnet upang i-repulse (Larawan 3c) ay hindi nagresulta sa mas maraming particle na naninirahan sa lugar ng imahe.Ang dalawang natuklasang ito ay nagpapakita na ang dual-magnet setup ay hindi makabuluhang nagpapabuti sa lokal na kontrol ng MP pointing, at na ang nagreresultang malakas na magnetic forces ay mahirap ibagay, na ginagawang mas praktikal ang diskarteng ito.Katulad nito, ang pag-orient sa magnet sa itaas at sa kabila ng trachea (Larawan 3d) ay hindi rin nadagdagan ang bilang ng mga particle na natitira sa lugar na may larawan.Maaaring hindi maging matagumpay ang ilan sa mga alternatibong pagsasaayos na ito dahil nagreresulta ang mga ito sa pagbawas sa lakas ng magnetic field sa deposition zone.Kaya, ang nag-iisang magnet na pagsasaayos sa 30 degrees (Larawan 3a) ay itinuturing na pinakasimpleng at pinaka-epektibo sa pamamaraan ng pagsubok sa vivo.
Ang pag-aaral ng LV-MP ay nagpakita na kapag ang mga LV vectors ay pinagsama sa CombiMag at naihatid pagkatapos na pisikal na maistorbo sa pagkakaroon ng magnetic field, ang mga antas ng transduction ay tumaas nang malaki sa trachea kumpara sa mga kontrol.Batay sa mga pag-aaral ng synchrotron imaging at mga resulta ng LacZ, lumilitaw na ang magnetic field ay maaaring panatilihin ang LV sa trachea at bawasan ang bilang ng mga particle ng vector na agad na tumagos nang malalim sa baga.Ang mga naturang pagpapahusay sa pag-target ay maaaring humantong sa mas mataas na kahusayan habang binabawasan ang mga naihatid na titer, hindi naka-target na transduction, nagpapasiklab at immune side effect, at mga gastos sa paglilipat ng gene.Mahalaga, ayon sa tagagawa, ang CombiMag ay maaaring gamitin kasama ng iba pang mga paraan ng paglilipat ng gene, kabilang ang iba pang mga viral vector (tulad ng AAV) at mga nucleic acid.